本文關(guān)鍵詞：新型NEK2抑制劑MBM-5抗腫瘤作用及其機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：NEK2是細胞周期調(diào)控蛋白相關(guān)的絲/蘇氨酸激酶家族中的一員,在細胞有絲分裂進程中發(fā)揮重要作用。其活性異常會導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定,中心體分離異常及多級紡錘體的形成。NEK2在許多惡性腫瘤細胞中高表達,與腫瘤的發(fā)生和惡化密切相關(guān)。同時,NEK2表達異常不僅導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定性增加,腫瘤細胞惡性增殖,而且促進細胞產(chǎn)生耐藥。NEK2與癌癥患者預(yù)后不良也存在一定聯(lián)系。因此,以NEK2為靶點的抑制劑有望成為治療腫瘤的新型分子靶向藥物。目前針對NEK2靶標(biāo)研發(fā)的小分子抑制劑普遍存在選擇性差、細胞活性不強、體內(nèi)抗腫瘤效果弱等問題。開發(fā)高活性和選擇性的NEK2抑制劑對于基礎(chǔ)研究和新藥研發(fā)均具有重要的意義。據(jù)文獻報道,改變NEK2激酶上的ATP結(jié)合位點,阻斷ATP與NEK2的結(jié)合可用于NEK2抑制劑的研究。本課題組通過改變NEK2與ATP結(jié)合位點設(shè)計合成了一系列對NEK2激酶具有潛在抑制活性的化合物。本研究旨在分子、細胞和整體動物水平對這一系列化合物的抗腫瘤活性進行評價,并對其作用機制進行研究。在課題研究中,我們首先采用EZ Reader (Caliper Life Science,LabChip(?) Systems)系列藥物篩選平臺對29個候選化合物進行NEK2激酶活性抑制作用檢測。發(fā)現(xiàn)在29個化合物中,有10個化合物對NEK2激酶具有較好的抑制作用,IC50值均小于10μM。且這些化合物中4-NK-005即MBM-5對NEK2激酶的抑制效果最好,IC50= 0.494μnM。同時用HTRF(?) KinEASETM-STK (Cisbio Assays)試劑盒驗證了這一結(jié)果。之后,我們用MTT法在人胃癌細胞株MGC-803上篩選系列化合物,發(fā)現(xiàn)其中有20個化合物具有非常好的抑制腫瘤細胞增殖的作用,它們的IC50值均在2μM以下,有的甚至低于1μM。結(jié)合之前的體外激酶活性抑制實驗結(jié)果,我們最終挑選出化合物MBM-5作為研究對象,并對其做進一步的研究。體外細胞生長抑制實驗的研究發(fā)現(xiàn),MBM-5對多種類型的腫瘤細胞的增殖抑制作用也較為顯著,尤其是在胃癌和結(jié)腸癌細胞株中,大部分IC50值小于1μM,且MBM-5對NEK2高表達細胞株的增值抑制作用更為明顯。因此后續(xù)實驗選用人胃癌細胞株MGC-803和人結(jié)腸癌細胞株HCT-116進行實驗。體內(nèi)異種移植瘤模型實驗治療中,MBM-5對人結(jié)腸癌HCT-116和人胃癌MGC-803腫瘤生長有一定抑制作用。在HCT-116模型,20mg/kg劑量腹腔注射的TGI為51.10%,而在MGC-803模型,30 mg/kg劑量組TGI為42.35%。SD大鼠的藥代實驗表明,MBM5在體內(nèi)代謝較快,t1/2非常短,這是其體內(nèi)活性較不理想的主要原因。因此,需要進一步優(yōu)化MBM-5,降低其體內(nèi)代謝速率,從而提高其抗腫瘤效果。接著我們對MBM-5的分子作用機制進行了研究。首先采用PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)分析MBM-5對腫瘤細胞周期分布的影響,結(jié)果表明經(jīng)MBM-5處理24h后,MGC-803和HCT-116細胞均被阻滯在G2/M期,高濃度MBM-5作用后G2/M期細胞比例均超過60%,并伴有多倍體細胞產(chǎn)生。且隨著MBM-5作用時間或作用濃度增加,周期阻滯效果越明顯。通過熒光顯微鏡我們也觀察到MGC-803經(jīng)MBM-5作用12h后,形成多核細胞,多核細胞數(shù)占總細胞數(shù)的13.79%,而對照組僅0.33%。同時,MGC-803細胞上還出現(xiàn)了染色體排布紊亂的現(xiàn)象,出現(xiàn)這一現(xiàn)象的細胞占總細胞數(shù)的7.09%,而對照組僅0.79%。經(jīng)MBM-5處理后的MGC-803細胞,其核形態(tài)發(fā)生明顯變化,呈棉絮狀,在同一個細胞中出現(xiàn)雙個甚至多個細胞核。MBM-5作用時間越長,核形態(tài)發(fā)生改變的細胞數(shù)越多。這與周期阻滯實驗結(jié)果一致,再次證明MBM-5能有效阻滯腫瘤細胞周期進程,形成多核細胞。上述結(jié)果表明MBM-5通過抑制NEK2激酶,能明顯干擾細胞有絲分裂進程,阻滯腫瘤細胞于G2/M期,導(dǎo)致染色體排布紊亂并形成多核細胞。接下來我們采用AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測MBM-5誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用。實驗結(jié)果表明,在MGC-803上MBM-5 2uM用藥24h后凋亡細胞由對照組的8.57%增加到72.84%,在HCT-116細胞上MBM-5 2uM用藥24h后細胞凋亡率從7.60%增加到45.43%。且隨著MBM-5作用時間或作用濃度增加,誘導(dǎo)細胞凋亡效果越明顯。Western Boltting結(jié)果也表明,在這兩株腫瘤細胞上,經(jīng)MBM-5處理后凋亡相關(guān)蛋白c-Caspase3和PARP-1表達發(fā)生變化,隨著MBM-5作用時間及作用濃度增加,c-Capase3和c-PARP-1逐漸增多。上述實驗證明新型NEK2抑制劑MBM-5具有誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。最后我們采用Western Blotting法檢測NEK2及其相關(guān)蛋白表達水平是變化。研究發(fā)現(xiàn)在MGC-803上隨著MBM-5作用濃度和作用時間的增加,NEK2及其相關(guān)蛋白Hec1表達水平減少,而與細胞周期相關(guān)的激酶Aurora A、Aurora B以及它們的磷酸化蛋白表達水平均未發(fā)生改變,這表明MBM-5阻止細胞周期進程是通過抑制NEK2激酶及其相關(guān)蛋白Hec1表達造成,與其他周期激酶如Aurora A、Aurora B等無關(guān)。接著,我們研究了MBM-5處理后腫瘤細胞上NEK2及其相關(guān)蛋白的降解通路。研究發(fā)現(xiàn),在MGC-803細胞上,MBM-5作用過程中加入MG-132(蛋白酶體抑制劑)后,NEK2蛋白逐漸累積恢復(fù)到與對照相同。相反,泛素-蛋白酶體途徑未受抑制的情況下,經(jīng)MBM-5處理后的細胞NEK2蛋白表達減少。NEK2的下游蛋白Hec-1降解方式與NEK2基本一致。但是AuroraA和Aurora B的表達水平未受影響。上述研究表明,MBM-5能促進泛素-蛋白酶體通路對NEK2及其相關(guān)蛋白Hec1的降解。因此,以改變NEK2的ATP結(jié)合位點,阻斷NEK2與ATP結(jié)合為目的設(shè)計的NEK2抑制劑MBM-5,具有良好的周期阻滯和誘導(dǎo)細胞凋亡的作用,能夠有效并專一地抑制NEK2激酶,表現(xiàn)出較為顯著的體內(nèi)外抗腫瘤活性。本研究為此類藥物的設(shè)計合成提供了實驗依據(jù),為NEK2抑制劑的研發(fā)提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：NEK2激酶 MBM5 細胞周期 細胞凋亡 抗腫瘤作用
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 內(nèi)容摘要6-9
• Abstract9-16
• 第一章 前言16-26
• 1. NEK2激酶及其功能16-19
• 1.1 NEK激酶家族16-17
• 1.2 NEK2激酶的結(jié)構(gòu)17-18
• 1.3 NEK2激酶的功能18-19
• 2. NEK2激酶與癌癥的關(guān)系19-23
• 2.1 NEK2激酶與腫瘤發(fā)生20
• 2.2 NEK2激酶與腫瘤耐藥20-22
• 2.3 NEK2激酶與腫瘤預(yù)后22-23
• 3. NEK2激酶抑制劑的研究現(xiàn)狀23-24
• 4. 研究目的和研究內(nèi)容24-26
• 第二章 NEK2抑制劑篩選26-36
• 1. 實驗材料26-28
• 1.1 化合物及試劑26-27
• 1.2 主要耗材27
• 1.3 化合物27
• 1.4 細胞株及培養(yǎng)條件27-28
• 2. 實驗儀器28
• 3. 實驗方法28-30
• 3.1 細胞培養(yǎng)28-29
• 3.2 化合物NEK2激酶抑制活性篩選29-30
• 3.2.1 利用EZ Reader藥物篩選平臺篩選化合物29
• 3.2.2 利用HTRF(?) KinEASE~(TM)-STK(Cisbio Assays)篩選化合物29-30
• 3.3 化合物體外細胞生長抑制活性篩選30
• 4. 實驗結(jié)果30-34
• 4.1 分子水平MBM系列化合物篩選30-32
• 4.1.1 EZ Reader檢測29個候選化合物對NEK2激酶的活性抑制作用30-31
• 4.1.2 HTRF(?) KinEASE~(TM)-STK試劑盒驗證MBM-5對NEK2激酶的抑制作用31-32
• 4.2 MBM-5能有效抑制MGC-803腫瘤細胞增殖32-34
• 5. 討論34-36
• 第三章 新型NEK2抑制劑MBM-5的體內(nèi)外抗腫瘤活性研究36-62
• 1. 實驗材料36-39
• 1.1 化合物及試劑36-37
• 1.2 主要耗材37
• 1.3 化合物37
• 1.4 細胞株及培養(yǎng)條件37-38
• 1.5 實驗動物38-39
• 2. 實驗儀器39
• 3. 實驗方法39-45
• 3.1 體外細胞水平檢測實驗方法39-43
• 3.1.1 化合物體外細胞生長抑制活性檢測39-40
• 3.1.2 免疫印跡40-42
• 3.1.3 統(tǒng)計分析42-43
• 3.2 體內(nèi)檢測實驗方法43-45
• 3.2.1 體內(nèi)藥物最大耐受劑量(MTD)檢測43
• 3.2.2 小鼠腫瘤細胞皮下接種43
• 3.2.3 小鼠分組43-44
• 3.2.4 小鼠腹腔注射44
• 3.2.5 數(shù)據(jù)處理44
• 3.2.6 SD大鼠藥代的實驗方法44-45
• 3.2.7 統(tǒng)計分析45
• 4. 實驗結(jié)果45-60
• 4.1 新型NEK2抑制劑MBM-5的體外抗腫瘤活性研究45-50
• 4.1.1 小分子化合物MBM-5能抑制多種癌細胞的生長45-47
• 4.1.2 MBM-5對NEK2高表達的細胞株具有較好的增值抑制作用47-48
• 4.1.3 小分子化合物MBM-5抑制腫瘤細胞生長的形態(tài)學(xué)觀察48-50
• 4.2 新型NEK2抑制劑MBM-5的體內(nèi)藥效學(xué)評價50-57
• 4.2.1 MBM-5體內(nèi)藥物最大耐受劑量(MTD)檢測50-51
• 4.2.2 MBM-5腹腔注射給藥能一定程度上抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤生長51-57
• 4.3 MBM-5的藥物代謝研究57-60
• 5. 討論60-62
• 第四章 MBM5抗腫瘤作用的分子機制研究62-91
• 1. 實驗材料62-63
• 1.1 化合物及試劑62-63
• 1.2 主要耗材63
• 1.3 化合物63
• 1.4 細胞株及培養(yǎng)條件63
• 2. 實驗儀器63
• 3. 實驗方法63-68
• 3.1 細胞周期PI檢測法63-64
• 3.2 細胞凋亡AnnexinV-FITC檢測法64-65
• 3.3 免疫熒光65-66
• 3.4 細胞周期同步化66-67
• 3.5 免疫印跡67
• 3.6 細胞轉(zhuǎn)染67-68
• 3.7 統(tǒng)計分析68
• 4. 實驗結(jié)果68-87
• 4.1 MBM-5能有效阻滯腫瘤細胞的細胞周期進程68-78
• 4.1.1 MBM-5能將腫瘤細胞阻滯在G2/M期,并伴有多倍體形成68-70
• 4.1.2 細胞同步化后,MBM-5也能有效阻滯細胞在G2/M期70-73
• 4.1.3 MBM-5干擾細胞有絲分裂,使染色體排布紊亂,形成多核細胞73-77
• 4.1.4 MBM-5對腫瘤細胞核形態(tài)變化的影響77-78
• 4.2 MBM-5具有誘導(dǎo)細胞凋亡的作用78-81
• 4.2.1 AnnexinV-FITC試劑盒檢測MBM-5具有誘導(dǎo)細胞凋亡的作用78-80
• 4.2.2 Western Blot檢測凋亡標(biāo)志蛋白PARP-1及c-Caspase3的表達80-81
• 4.3 MBM-5通過抑制NEK2及其相關(guān)蛋白的表達來抑制腫瘤細胞增殖81-84
• 4.4 MBM-5可能通過泛素-蛋白酶體途徑降解NEK2及其相關(guān)蛋白Hec184-85
• 4.5 可能由于細胞內(nèi)源性NEK2表達干擾,MBM-5對過表達外源NEK2的細胞株的增值抑制作用與親本株無異85-87
• 5. 討論87-91
• 第五章 總結(jié)91-93
• 附錄93-96
• 攻讀碩士學(xué)位期間所發(fā)表文章及首頁96-97
• 附件97-98
• 縮略詞98-100
• 參考文獻100-103
• 致謝103-104

【相似文獻】

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1 曾彥茹;NEK2與前列腺癌侵襲性和預(yù)后的相關(guān)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

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1 孔燕楠;新型NEK2抑制劑MBM-5抗腫瘤作用及其機制研究[D];華東師范大學(xué);2016年

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本文編號：407921