肺表面活性蛋白B(SP-B)來(lái)源于肺泡II型上皮細(xì)胞,是構(gòu)成肺表面活性物質(zhì)進(jìn)化最早、不可或缺的疏水性蛋白之一。其主要功能是促進(jìn)磷脂分子擴(kuò)散,增加單分子膜的穩(wěn)定性,提高脂質(zhì)-蛋白復(fù)合物的表面活性,具有調(diào)節(jié)肺泡氣液界面表面張力的功能。急性肺損傷(ALI)過(guò)程中炎癥因子會(huì)導(dǎo)致肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞形態(tài)、功能發(fā)生變化,表面活性物質(zhì)合成減少;而SP-B合成的減少、構(gòu)像的改變及活性的降低,會(huì)進(jìn)一步加重ALI的病理過(guò)程。重組瑞替普酶(r-PA)是第三代溶栓藥物,能有效清除心、肺等部位血管中出現(xiàn)的凝血塊,r-PA與SP-B的融合蛋白能為ALI替補(bǔ)治療開(kāi)發(fā)一個(gè)新型的基因工程藥物。研究目的:本課題研究目的在于構(gòu)建、表達(dá)r-PA與SP-B的融合蛋白,通過(guò)摸索SP-B融合表達(dá)的特性,使其既具有r-PA清除凝血塊的作用,又具有SP-B表面活性功能的特點(diǎn),為ALI替補(bǔ)治療開(kāi)發(fā)新型的基因工程藥物。研究方法:(1)研究SP-B融合表達(dá)的特性。SP-B難以用常規(guī)氨基酸合成方法獲得,先通過(guò)合成成熟SP-B的基因,構(gòu)建在質(zhì)粒pGEX4T-1上,將GST-tag與SP-B融合,后用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),利用Western Blot檢測(cè)...

【文章頁(yè)數(shù)】：66 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略表
1 引言
    1.1 肺表面活性物質(zhì)的組成
    1.2 肺表面活性蛋白B的結(jié)構(gòu)與功能
    1.3 肺表面活性蛋白B的生物物理活性
    1.4 急性肺損傷與肺表面活性蛋白B
    1.5 瑞替普酶
    1.6 研究目的及意義
    1.7 研究?jī)?nèi)容及技術(shù)路線
2 肺表面活性蛋白B的融合表達(dá)特性研究
    2.1 材料與儀器
        2.1.1 主要試劑
        2.1.2 主要儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 SP-B基因合成與引物設(shè)計(jì)
        2.2.2 SP-B的PCR擴(kuò)增
        2.2.3 pGEX4T-1/SP-B表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.4 IPTG誘導(dǎo)SP-B表達(dá)
        2.2.5 Western Blot檢測(cè)SP-B的表達(dá)
        2.2.6 GST/SP-B蛋白的純化
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 稀有密碼子的優(yōu)化
        2.3.2 GST/SP-B融合表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.3 重組蛋白的表達(dá)與分析
        2.3.4 Western Blot結(jié)果分析
        2.3.5 重組蛋白的純化結(jié)果
    2.4 結(jié)論與討論
3 r-PA/SP-B融合表達(dá)載體構(gòu)建
    3.1 材料與儀器
        3.1.1 主要試劑
        3.1.2 主要儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 設(shè)計(jì)依據(jù)
        3.2.2 r-PA基因序列與SP-B基因來(lái)源
        3.2.3 融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.4 融合表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 融合表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果
        3.3.2 融合表達(dá)質(zhì)粒鑒定結(jié)果
        3.3.3 融合表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果
        3.3.4 融合表達(dá)質(zhì)粒Western Blot檢測(cè)結(jié)果
    3.4 結(jié)論與討論
4 r-PA/SP-B的細(xì)胞熒光定位
    4.1 材料與儀器
        4.1.1 主要試劑材料
        4.1.2 主要儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        4.2.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率
        4.2.3 r-PA與r-PA/SP-B的細(xì)胞熒光定位
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果
        4.3.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞毒性分析結(jié)果
        4.3.3 pEZ-M03質(zhì)粒在CCL149細(xì)胞中的熒光定位
        4.3.4 r-PA細(xì)胞熒光定位結(jié)果
        4.3.5 r-PA/SP-B細(xì)胞熒光定位結(jié)果
    4.4 結(jié)論與討論
5 基于ALI的r-PA/SP-B功能研究
    5.1 材料與儀器
        5.1.1 主要試劑材料
        5.1.2 主要儀器
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染
        5.2.2 細(xì)胞損傷模型的構(gòu)建
        5.2.3 細(xì)胞拉曼光譜掃描
        5.2.4 r-PA/SP-B纖溶酶活性的測(cè)定
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 細(xì)胞損傷模型構(gòu)建結(jié)果
        5.3.2 CCL149細(xì)胞損傷模型融合蛋白的定位
        5.3.3 細(xì)胞拉曼光譜掃描結(jié)果
        5.3.4 r-PA/SP-B纖溶酶活性測(cè)定結(jié)果
    5.4 結(jié)論與討論
6 總結(jié)與展望
    6.1 總結(jié)
    6.2 展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄



本文編號(hào)：3828493