p38α是一種絲裂原活化蛋白激酶(MAPK),其涉及的信號通路與細胞炎癥、細胞凋亡、細胞分化、心肌肥大、細胞周期密切相關(guān),這也讓p38α成為具吸引力的藥物設計靶標。核受體涉及細胞的生長、發(fā)育、穩(wěn)態(tài)以及其他多種生理活動,在癌癥、炎癥、代謝和增生性疾病中起著基礎(chǔ)性作用。孤兒核受體Nur77作為其中的重要一員,也引起研究者的廣泛關(guān)注。前期研究發(fā)現(xiàn)p38α與Nur77存在相互作用,會導致LPS所誘導的炎癥反應,但Nur77與p38α的作用模式目前還缺乏研究。本課題以此為出發(fā)點,通過結(jié)構(gòu)生物學研究揭示p38α與Nur77之間相互作用的模式,為針對p38α的藥物設計尋找新靶點。為此,我們設計了Nur77-LBD多肽,利用ITC檢測其中兩條多肽與p38α存在相互作用,并對其復合物結(jié)晶條件進行篩選,初步獲得疑似復合物晶體的結(jié)晶條件。同時,我們成功表達純化出狀態(tài)穩(wěn)定的15N p38α蛋白,通過p38α與Nur77-LBD的核磁共振化學位移擾動實驗,指認出位于p38α上信號發(fā)生減弱的五個氨基酸位點,為后續(xù)對相互作用位點的確定奠定了基礎(chǔ)。除了以上研究,我們還開展了基于p38α晶體結(jié)構(gòu)的藥物篩選,確定了兩個片...

【文章頁數(shù)】：87 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1. 前言
    1.1 MAPK信號通路概述
        1.1.1 ERK1/2信號通路
        1.1.2 ERK5信號通路
        1.1.3 JNK信號通路
    1.2 p38信號通路
        1.2.1 p38的分類
        1.2.2 p38α結(jié)構(gòu)特點
        1.2.3 p38α的激活機制
        1.2.4 p38α下游底物
        1.2.5 p38α激活的生物學功能
        1.2.6 p38α抑制劑研究進展
    1.3 孤兒核受體Nur77概述
        1.3.1 核受體超家族的分類
        1.3.2 孤兒核受體Nur77的結(jié)構(gòu)特點
        1.3.3 Nur77相關(guān)的生理功能
        1.3.4 p38α與Nur77研究進展
    1.4 基于片段化的藥物發(fā)現(xiàn)
    1.5 本課題研究目的及意義
2. 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 質(zhì)粒與菌株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
    2.2 實驗試劑的配制
        2.2.1 分子克隆相關(guān)試劑
        2.2.2 培養(yǎng)基及細菌培養(yǎng)相關(guān)試劑
        2.2.3 SDS-PAGE相關(guān)試劑
        2.2.4 蛋白表達及純化相關(guān)試劑
    2.3 實驗方法
        2.3.1 重組蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.3.1.1 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備
            2.3.1.2 引物設計
            2.3.1.3 目的基因的PCR擴增與回收
            2.3.1.4 表達質(zhì)粒雙酶切
            2.3.1.5 LIC法構(gòu)建重組表達質(zhì)粒
            2.3.1.6 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
            2.3.1.7 抽提質(zhì)粒
            2.3.1.8 定點突變
            2.3.1.9 陽性克隆的鑒定
        2.3.2 重組蛋白的表達
            2.3.2.1 重組蛋白的試表達
            2.3.2.2 重組蛋白的大量誘導表達
        2.3.3 重組蛋白的純化
            2.3.3.1 Ni柱親和層析
            2.3.3.2 重組蛋白濃縮與脫鹽
            2.3.3.3 離子交換層析
            2.3.3.4 凝膠過濾層析
        2.3.4 重組蛋白性質(zhì)檢測
        2.3.5 重組蛋白的結(jié)晶
            2.3.5.1 結(jié)晶條件的初步篩選
            2.3.5.2 結(jié)晶條件的優(yōu)化
            2.3.5.3 蛋白晶體與小分子的soaking實驗
            2.3.5.4 蛋白晶體衍射數(shù)據(jù)的收集
            2.3.5.5 蛋白晶體的結(jié)構(gòu)解析
        2.3.6 重組蛋白的相互作用分析
            2.3.6.1 等溫滴定量熱法(ITC)
            2.3.6.2 NMR實驗
3. 實驗結(jié)果與分析
    3.1 p38α蛋白的表達
    3.2 p38α蛋白的純化
        3.2.1 Ni柱親和層析純化
        3.2.2 脫鹽
        3.2.3 離子交換層析
        3.2.4 凝膠過濾層析
    3.3 p38α蛋白性質(zhì)檢測
    3.4 p38α與Nur77-LBD多肽相互作用研究
        3.4.1 Nur77-LBD多肽的合成與分析
        3.4.2 p38α與Nur77-LBD多肽相互作用檢測
            3.4.2.1 ITC實驗
            3.4.2.2 NMR實驗
        3.4.3 p38α與Nur77-LBD多肽共結(jié)晶條件篩選
        3.4.4 p38α與Nur77-LBD多肽復合物結(jié)晶條件優(yōu)化
        3.4.5 討論與總結(jié)
    3.5 p38α的藥物篩選
        3.5.1 p38α蛋白的結(jié)晶
        3.5.2 p38α與片段小分子復合物的獲得
        3.5.3 衍射數(shù)據(jù)的收集及結(jié)構(gòu)解析
        3.5.4 討論與總結(jié)
    3.6 展望
參考文獻
致謝



本文編號：3756473