本文關(guān)鍵詞：NLRC5的甲基化修飾對(duì)巨噬細(xì)胞表型變化的調(diào)控作用和部分機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：巨噬細(xì)胞是先天免疫反應(yīng)中必不可少的組成成分,它來(lái)源于外周血中的單核細(xì)胞,當(dāng)單核細(xì)胞從循環(huán)系統(tǒng)中遷移和通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞外滲,進(jìn)一步分化成各種組織駐留的巨噬細(xì)胞。類似于Th1/Th2細(xì)胞分化,巨噬細(xì)胞在不同的微環(huán)境下也可以分化為兩種成熟的表型,通常被稱作M1型和M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞也稱之為經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞,可由干擾素γ(IFN-γ)或與脂多糖(LPS)共同刺激產(chǎn)生,而M2型(即選擇性活化的巨噬細(xì)胞)可由各種細(xì)胞因子誘導(dǎo),包括IL-4、IL-13和免疫復(fù)合物等。一般來(lái)說(shuō),M1型活化的巨噬細(xì)胞高表達(dá)IL-12和IL-23,低表達(dá)IL-10;代謝精氨酸,產(chǎn)生高水平的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(i NOS),此外M1型巨噬細(xì)胞分泌大量的促炎因子如IL-1β,IL-6和TNF-α等。相反,M2型活化的巨噬細(xì)胞高表達(dá)IL-10,低表達(dá)IL-12和Il-23,并產(chǎn)生精氨酸酶。更重要的是,這兩種表型的巨噬細(xì)胞具有復(fù)雜的異質(zhì)性和功能的多樣性,其中許多特征相互矛盾:包括促炎癥活性和抗炎活性,促腫瘤活性和抗腫瘤活性,免疫原性和免疫耐受性,還有組織破壞性和組織修復(fù)性。上述的這些表型和功能變化的巨噬細(xì)胞對(duì)于很多疾病都具有重要作用,例如肝纖維化、腫瘤、肥胖癥等。靶向巨噬細(xì)胞表型變化并針對(duì)這些疾病的微環(huán)境來(lái)相應(yīng)地改變巨噬細(xì)胞的表型可能成為治療疾病的新的希望。但是目前巨噬細(xì)胞的表型變化以及潛在的機(jī)制尚未明確。NOD樣受體家族,是最近被發(fā)現(xiàn)的免疫系統(tǒng)中的一個(gè)模式識(shí)別受體,已經(jīng)被證明可以調(diào)控炎癥反應(yīng)和Ⅰ類MHC轉(zhuǎn)錄。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)NOD樣受體家族的成員之一,NLRC5(由氨基酸的CARD樣區(qū)域、中間的NOD樣區(qū)和羧基端的亮氨酸重復(fù)序列區(qū)域三部分組成)對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌有著負(fù)性調(diào)控的作用,也證實(shí)了NLRC5對(duì)肝纖維化的作用及可能機(jī)制(NF-κB信號(hào)通路)。根據(jù)NLRC5能夠有效抑制機(jī)體的天然免疫和炎癥反應(yīng),進(jìn)一步探索NLRC5是否對(duì)巨噬細(xì)胞表型變化起到調(diào)控作用并探討潛在的機(jī)制,本研究主要分為以下幾個(gè)部分:1.建立RAW264.7細(xì)胞的M1和M2兩種表型變化模型。選用RAW264.7(小鼠腹腔巨噬細(xì)胞株)為研究對(duì)象,使用LPS(1000 ng/ml)和IFN-γ(10ng/ml)共同作用12 h誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化,而使用IL-4(15ng/ml)刺激細(xì)胞向M2型變化。2.NLRC5在兩種表型變化巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)研究的對(duì)象是RAW264.7細(xì)胞,分別用RTq-PCR和Western Blot法檢測(cè)NLRC5在兩種表型變化的巨噬細(xì)胞中m RNA和蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,M1表型的巨噬細(xì)胞中NLRC5的表達(dá)降低,而M2中NLRC5的表達(dá)升高,重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析,與正常組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.NLRC5的下游調(diào)控機(jī)制研究。實(shí)驗(yàn)研究的對(duì)象是RAW264.7細(xì)胞。有文獻(xiàn)報(bào)道Notch信號(hào)通路在M1型巨噬細(xì)胞表型變化中起到重要的作用,本文通過(guò)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染NLRC5 RNAi和p EGFP-C2-NLRC5后使用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,Western Blot法檢測(cè)NLRC5沉默和過(guò)表達(dá)后Notch1以及下游蛋白Hes1的表達(dá),結(jié)果提示NLRC5調(diào)控M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化可能是由Notch信號(hào)通路介導(dǎo)的。4.NLRC5的上游調(diào)控機(jī)制研究。以RAW264.7細(xì)胞為研究對(duì)象,RT-q PCR和Western Blot結(jié)果顯示在M1型表型變化的巨噬細(xì)胞給予甲基化抑制劑(5-azad C)可以明顯增加NLRC5的表達(dá),并同時(shí)也可以減少M(fèi)1型標(biāo)志物(i NOS、TNF-α)的表達(dá),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;然后我們利用焦磷酸測(cè)序的方法檢測(cè)NLRC5啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài),進(jìn)一步證明了NLRC5在M1型巨噬細(xì)胞中甲基化的發(fā)生;再次,我們通過(guò)小干擾RNA對(duì)甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑1(DNMT1)進(jìn)行沉默,結(jié)果發(fā)現(xiàn)M1巨噬細(xì)胞中NLRC5的表達(dá)降低可能是NLRC5的高甲基化引起的。
【關(guān)鍵詞】：巨噬細(xì)胞表型變化 NLRC5 DNMT1 Notch信號(hào) RAW264.7
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 英文縮咯詞6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 1. 前言14-15
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)方法15-33
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料15-17
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞15
• 2.1.2 主要試劑15-16
• 2.1.3 儀器與設(shè)備16-17
• 2.1.4 圖像分析軟件17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法17-33
• 2.2.1 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)17
• 2.2.2 RAW264.7細(xì)胞表型變化模型的建立與鑒定17-18
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)容與方法18-33
• 3. 結(jié)果33-50
• 3.1 RAW264.7細(xì)胞M1和M2表型變化模型的建立與鑒定33-37
• 3.1.1 RAW264.7細(xì)胞表型變化模型的建立33-35
• 3.1.2 RAW264.7細(xì)胞表型變化模型的鑒定35-37
• 3.2 NLRC5對(duì)RAW264.7細(xì)胞M1和M2的調(diào)控作用37-43
• 3.2.1 RAW264.7細(xì)胞M1和M2模型中NLRC5mRNA和蛋白表達(dá)的變化37-38
• 3.2.2 過(guò)表達(dá)NLRC5抑制RAW264.7細(xì)胞M1表型變化38-41
• 3.2.3 沉默NLRC5促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞M1表型變化41-43
• 3.3 NLRC5通過(guò)Notch1信號(hào)調(diào)控M1表型變化43-45
• 3.3.1 Notch1在巨噬細(xì)胞表型變化過(guò)程中的表達(dá)43-44
• 3.3.2 沉默和過(guò)表達(dá)NLRC5對(duì)Notch信號(hào)通路和M1表型變化標(biāo)志物蛋白表達(dá)的影響44-45
• 3.4 NLRC5的上游調(diào)控機(jī)制45-50
• 3.4.1 NLRC5在RAW264.7細(xì)胞M1和M2中的甲基化狀態(tài)45-46
• 3.4.2 DNA甲基化抑制劑5-azadC對(duì)RAW264.7細(xì)胞的影響46-48
• 3.4.3 DNMT1調(diào)控RAW264.7細(xì)胞1表型變化48-50
• 4. 討論50-53
• 5. 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 附錄58-60
• 致謝60-61
• 綜述61-80
• References74-80

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：365135