本文關(guān)鍵詞：三條谷胱甘肽生物合成途徑在釀酒酵母中組合表達(dá)的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：谷胱甘肽(Glutathione, GSH)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的生物活性三肽化合物。半胱氨酸殘基上的巰基使其在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的生理功能,如抗氧化、解毒和免疫調(diào)控等。GSH已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)。在大多數(shù)生物體內(nèi),GSH主要由y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gsh1)和谷胱甘肽合成酶(Gsh2)兩個(gè)酶依次催化合成；在一些致病性革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中,存在一種雙功能的合成酶(GshF)可單獨(dú)催化GSH的合成；此外,在Gsh1缺陷的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一條GSH合成的替代途徑,通過參與脯氨酸生物合成的第一個(gè)功能蛋白酶γ-谷氨酰激酶(GK)的功能來實(shí)現(xiàn)對(duì)Gsh1的替代作用。隨著對(duì)GSH生物合成和代謝過程的深入研究,利用基因工程手段構(gòu)建GSH高產(chǎn)菌株,然后進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵是GSH生產(chǎn)的最有效手段,關(guān)于Gshl/Gsh2或GshF在宿主細(xì)胞中單獨(dú)高表達(dá)的研究有很多。本研究希望提供一個(gè)新的技術(shù)方法,即將目前發(fā)現(xiàn)的三條GSH合成途徑在宿主細(xì)胞中進(jìn)行組合表達(dá),進(jìn)一步增強(qiáng)工程菌GSH的合成能力,為工業(yè)化生產(chǎn)提供新的技術(shù)方案。主要研究結(jié)果如下：一、γ-谷氨酰激酶參與的GSH合成途徑的確證和GSH的合成通過敲除釀酒酵母內(nèi)源的gshl基因,同時(shí)替換為釀酒酵母和大腸桿菌的γ-谷氨酰激酶編碼基因,然后比較獲得的重組菌株對(duì)過氧化氫的耐受性,發(fā)現(xiàn)高表達(dá)釀酒酵母自身的γ-谷氨酰激酶(Pro1)可增強(qiáng)Gshl缺陷的菌株對(duì)過氧化氫的耐受性；在釀酒酵母W303-1b中高表達(dá)γ-谷氨酰激酶-連接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白(Pro1-GshB),獲得的重組菌株W303-1b/P的GSH合成能力得到一定程度的提升。結(jié)果表明高表達(dá)Pro1可以通過積累Y-谷氨酰磷酸進(jìn)而合成GSH。二、三條GSH生物合成途徑的組合表達(dá)和GSH的合成在釀酒酵母W303-1b中高表達(dá)谷胱甘肽合成酶-連接肽-γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶融合蛋白(Gsh2-Gsh1),獲得重組菌株W303-1b/G,與工程菌W303-1 b/P和實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建重組菌株W303-1b/F(高表達(dá)雙功能酶GshF)一起代表高表達(dá)單途徑工程菌,對(duì)三條GSH合成途徑進(jìn)行組合表達(dá),獲得重組雙途徑組合工程菌W303-1b/FG、W303-1b/FP和三途徑組合工程菌W303-1b/FGP。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明W303-1b/F在單途徑工程菌中GSH產(chǎn)量最高,為187 mg/L,單位OD值的產(chǎn)量為2.45 mg/L/OD,組合新的途徑可進(jìn)一步提高GSH產(chǎn)量,三途徑組合菌株W303-lb/FGP的產(chǎn)量最高,為217 mg/L,單位OD值GSH產(chǎn)量為2.78 mg/L/OD;前體氨基酸添加實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了三個(gè)途徑組合的優(yōu)勢(shì),表現(xiàn)出更強(qiáng)的前體氨基酸轉(zhuǎn)化能力,通過添加前體,W303-lb/FGP的GSH產(chǎn)量提高61.37%,而單途徑菌株W303-1b/F的GSH產(chǎn)量?jī)H提高43.17%。三、10L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)對(duì)三途徑工程菌W303-1b/FGP進(jìn)行了10L發(fā)酵罐放大培養(yǎng),為菌株的高密度發(fā)酵做初步探索。結(jié)果表明,工程菌在放大培養(yǎng)中穩(wěn)定性較好,通過利用發(fā)酵罐控制發(fā)酵參數(shù),與搖瓶相比發(fā)酵周期明顯縮短,發(fā)酵24 h后GSH產(chǎn)量達(dá)273 mg/L,單位OD值的產(chǎn)量為2.7 mg/L/OD,通過補(bǔ)糖可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)生物量與產(chǎn)量的提升。綜上所述,三途徑組合方法進(jìn)一步提高了工程菌GSH的合成能力,三途徑工程菌打破了單途徑工程菌產(chǎn)量的瓶頸,其在GSH工業(yè)生產(chǎn)上具有很大潛力,為進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)菌株的優(yōu)化提供技術(shù)借鑒。
【關(guān)鍵詞】：谷胱甘肽 三途徑組合 釀酒酵母
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R914
【目錄】：

• 符號(hào)縮寫說明5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一章 前言10-14
• 1.1 谷胱甘肽的基本介紹10
• 1.2 GSH的生理功能及應(yīng)用10-11
• 1.3 GSH的生物合成11-12
• 1.4 GSH的生產(chǎn)方式12-13
• 1.5 本課題主要研究?jī)?nèi)容和目的13-14
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與常用實(shí)驗(yàn)方法14-23
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料14-17
• 2.2 常用實(shí)驗(yàn)方法17-23
• 第三章 γ-谷氨酰激酶參與GSH合成的功能鑒定和GSH的合成研究23-39
• 3.1 引言23
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料23
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法23-33
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-37
• 3.4.1 替代途徑相關(guān)基因克隆33
• 3.4.2 替代途徑同源整合表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定33
• 3.4.3 gsh1基因敲除載體的構(gòu)建與鑒定33
• 3.4.4 重組gsh1基因敲除菌株轉(zhuǎn)化與鑒定33-35
• 3.4.5 重組替代途徑高表達(dá)菌株轉(zhuǎn)化與鑒定35-36
• 3.4.6 重組gsh1基因敲除菌株對(duì)H_2O_2的耐受36-37
• 3.4.7 重組替代途徑高表達(dá)菌株搖瓶發(fā)酵合成GSH37
• 3.5 小結(jié)與討論37-39
• 第四章 三條GSH生物合成途徑組合研究39-55
• 4.1 引言39
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料39-41
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法41-47
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-54
• 4.4.1 釀酒酵母gsh2和gsh1的基因克隆47-48
• 4.4.2 標(biāo)準(zhǔn)途徑同源整合表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定48
• 4.4.3 重組標(biāo)準(zhǔn)途徑高表達(dá)菌株轉(zhuǎn)化與鑒定48-49
• 4.4.4 重組標(biāo)準(zhǔn)途徑高表達(dá)菌株搖瓶發(fā)酵合成GSH及三條GSH合成途徑比較49
• 4.4.5 雙功能酶途徑基因劑量對(duì)GSH產(chǎn)量的影響49-50
• 4.4.6 重組三途徑組合高表達(dá)菌株轉(zhuǎn)化與鑒定50-51
• 4.4.7 重組三途徑組合高表達(dá)菌株搖瓶發(fā)酵合成GSH51-52
• 4.4.8 氨基酸前體添加對(duì)工程菌GSH產(chǎn)量和生物量的影響52-54
• 4.5 小結(jié)與討論54-55
• 第五章 10L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)55-60
• 5.1 引言55
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料55-56
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法56-57
• 5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果57-59
• 5.4.1 批次發(fā)酵57
• 5.4.2 補(bǔ)料分批發(fā)酵57-59
• 5.5 小結(jié)與討論59-60
• 第六章 結(jié)論與展望60-62
• 6.1 論文總結(jié)60-61
• 6.2 展望61-62
• 本論文的創(chuàng)新點(diǎn)62-63
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 文獻(xiàn)綜述：谷胱甘肽胞外發(fā)酵研究進(jìn)展67-77
• 參考文獻(xiàn)73-77
• 附錄77-84
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷、碩士期間論文和專利84-85
• 致謝85-86

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王瑋瑋;唐亮;周文龍;楊燕;高波;趙云峰;王偉;;谷胱甘肽生物合成及代謝相關(guān)酶的研究進(jìn)展[J];中國(guó)生物工程雜志;2014年07期

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 楊建花;新型雙功能谷胱甘肽合成酶的克隆表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用研究[D];華東理工大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：三條谷胱甘肽生物合成途徑在釀酒酵母中組合表達(dá)的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：362774