本文關鍵詞：Omi切割Hax-1加劇腦缺血再灌注損傷的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:觀察絲氨酸蛋白酶Omi在大腦缺血再灌注損傷中的作用,進一步探究其分子機制。方法:體外培養(yǎng)小鼠成神經(jīng)細胞瘤(N2a)細胞,建立缺氧缺糖/復氧復糖(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)細胞模型。利用線栓堵塞ICR小鼠大腦中動脈,建立短暫性大腦中動脈缺血再灌注(transient middle cerebral artery occlusion/reperfusion,t MCAO/R)動物模型。利用這兩種模型,我們用Western blot法檢測N2a細胞與鼠腦缺血皮層組織中Omi與Hax-1蛋白水平的改變。N2a細胞敲減Omi后檢測Hax-1蛋白水平的變化,觀察OGD/R下Omi對Hax-1表達的影響。利用蛋白酶體抑制劑MG132(10μM)與自噬溶酶體抑制劑Bafilomycin A1(1μM)處理N2a細胞,分析OGD/R下Hax-1蛋白含量。利用MTT法與Western blot法檢測OGD/R下N2a細胞過表達Hax-1或加入Omi蛋白酶體抑制劑UCF-101(10μM)對細胞生存活力的影響,同時檢測細胞中相應Omi與Hax-1蛋白水平的變化。免疫熒光法檢測Omi與Hax-1在細胞中的定位。Tetramethylrhodamine methyl ester(TMRM)或Hoechst染色結合Western blot法檢測OGD/R下N2a細胞過表達Hax-1或UCF-101處理對線粒體膜電勢與細胞凋亡的作用,同時檢測細胞caspase-3活化情況。通過Western blot法檢測腹腔注射UCF-101(7.15 mg/kg)后小鼠大腦缺血皮層組織中Hax-1蛋白水平的變化與caspase-3活化情況。最后用2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)染色法計算腦缺血梗死體積,觀察UCF-101在小鼠缺血再灌注損傷的作用。結果:Western blot檢測發(fā)現(xiàn)OGD/R細胞模型與t MCAO/R動物模型中Omi蛋白表達上升,Hax-1蛋白表達下降。N2a細胞敲減Omi,OGD/R下Hax-1表達上升,表明Omi對Hax-1的表達有調(diào)控作用。N2a細胞加入蛋白酶體抑制劑MG132或自噬溶酶體抑制劑Bafilomycin A1處理后,OGD/R下Hax-1蛋白水平?jīng)]有明顯上升,表明Hax-1降解與泛素蛋白酶體系統(tǒng)或自噬溶酶體系統(tǒng)關系不大。MTT實驗發(fā)現(xiàn)N2a細胞過表達Hax-1或加入UCF-101處理后,細胞抗缺氧缺糖能力增強,生存活力提高。免疫熒光實驗表明Omi與Hax-1都定位于線粒體。TMRM與Hoechst染色表明,N2a細胞過表達Hax-1或加入UCF-101處理后OGD/R下線粒體膜電勢恢復,細胞核皺縮減少,活化型caspase-3水平降低,凋亡減少。Western blot與TTC染色發(fā)現(xiàn)UCF-101作用下,鼠腦缺血皮層Hax-1蛋白水平回升,活化型caspase-3降低,腦梗死體積減少,表明UCF-101在腦缺血再灌注損傷發(fā)生中具有保護作用。結論:Omi加劇小鼠腦缺血再灌注損傷,其作用機制可能是Omi通過切割抗凋亡蛋白Hax-1,破壞線粒體膜完整性,引起細胞凋亡。Omi抑制劑UCF-101抑制Omi活性,增加Hax-1蛋白量,實現(xiàn)對腦缺血再灌注損傷的保護作用。
【關鍵詞】：Omi 缺血再灌注損傷 Hax-1 UCF-101
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R965
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-12
• 材料和方法12-28
• 1. 實驗材料12-17
• 2. 方法和步驟17-27
• 3. 統(tǒng)計學方法27-28
• 結果28-40
• 1. 細胞OGD/R模型與小鼠tMCAO/R模型中Omi與Hax-1 蛋白水平的檢測28-30
• 2. OGD/處理下Omi調(diào)控Hax-1 表達30-31
• 3. 過表達Hax-1 或抑制Omi蛋白酶活性保護OGD/R誘導的神經(jīng)元死亡31-33
• 4. 抑制Omi蛋白酶活性或過表達Hax-1 保護線粒體膜的完整性33-36
• 5. 抑制Omi蛋白酶活性或過表達Hax-1 減弱OGD/R誘導的細胞凋亡36-38
• 6. UCF-101 提高Hax-1 水平保護小鼠腦缺血再灌注損傷38-40
• 討論40-43
• 結論43-44
• 參考文獻44-48
• 綜述48-57
• 參考文獻52-57
• 英文縮寫詞表57-58
• 攻讀學位期間公開發(fā)表的論文58-59
• 致謝59-60

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