本文關(guān)鍵詞：ABIN-1對MOR功能的調(diào)節(jié)機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：阿片類藥物具有強效鎮(zhèn)痛作用,但反復(fù)使用后,容易出現(xiàn)依賴和耐受而引起成癮,因此大大限制了其在臨床上的使用。多年來,國內(nèi)外學(xué)者從阿片受體和非阿片受體系統(tǒng)等多個方面探索阿片成癮機制,取得了很大進展,但有關(guān)阿片成癮的分子生物學(xué)機制仍未闡明。近年來,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,人們發(fā)現(xiàn)一些蛋白能通過與阿片受體的相互作用影響阿片受體功能。因此,尋找與阿片受體相互作用的蛋白,研究其對阿片受體功能的影響,對闡明阿片成癮的機制具有重要意義。A20結(jié)合核因子抑制蛋白(A20 binging inhibitor of NF-κB activation, ABIN-1)為新發(fā)現(xiàn)的免疫和炎癥性疾病相關(guān)的細胞內(nèi)重要調(diào)節(jié)蛋白,目前尚未見其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布及功能研究的相關(guān)報道。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn),ABIN-1的mRNA及蛋白在大、小鼠腦前皮層、海馬、紋狀體、伏隔核等腦區(qū)有廣泛分布,且在嗎啡慢性作用后,ABIN-1在各腦區(qū)表達明顯上調(diào),因而推測該蛋白與阿片依賴關(guān)系密切。前期研究中在CHO上初步確定了ABIN-1與μ-阿片受體(μ-opioid receptor, MOR)存在相互作用,ABIN-1過表達后能抑制MOR激動活性,對激動劑作用于MOR后受體的內(nèi)吞及脫敏也有抑制作用�；诖�,本課題開展了如下研究。研究目的：1、在體驗證ABIN-1與MOR的相互作用,進一步驗證ABIN-1與其他GPCR有無相互作用。2、研究ABIN-1對MOR功能的調(diào)節(jié)機制。研究方法：1、在SH-SY5Y細胞及大鼠腦皮層中采用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)實驗驗證ABIN-1與MOR是否存在相互作用。2、通過Co-IP實驗分析ABIN-1與δ-阿片受體(δ-opioid receptor, DOR)、κ-阿片受體(K-opioid receptor, KOR)等阿片受體及非阿片受體有無相互作用,明確ABIN-1與MOR的相互作用是否具有特異性。3、在受體水平上,用免疫沉淀法觀察ABIN-1對MOR磷酸化、泛素化及脫磷酸化的影響；通過實時定量PCR (RT-qPCR)初步篩選ABIN-1調(diào)節(jié)的信號分子；在mRNA水平及蛋白水平篩選有效干擾ABIN-1的siRNA,驗證調(diào)控ABIN-1表達對MOR磷酸化的調(diào)節(jié)作用。4、在受體后水平,用免疫印跡法分析過表達ABIN-1對MOR激活后ERK磷酸化及CREB磷酸化的影響。實驗結(jié)果：1、Co-IP實驗表明在SH-SY5Y細胞及大鼠腦皮層ABIN-1與MOR存在相互作用,與過表達ABIN-1及MOR的CHO細胞上結(jié)果一致,進一步證明ABIN-1與MOR存在相互作用。2、連續(xù)7天給大鼠嗎啡5-35 mg/kg (s.c.)處理后,取大鼠腦皮層通過Co-IP實驗驗證ABIN-1與MOR的相互作用,結(jié)果表明嗎啡處理組ABIN-1與MOR的相互作用明顯強于鹽水組；10μM嗎啡或1DAMGO處理SH-SY5Y細胞24 h后,ABIN-1與MOR相互作用也明顯增強,表明激動劑慢性作用于MOR后能促進ABIN-1與MOR的相互作用,并進一步證實ABIN-1與MOR存在相互作用。3、將ABIN-1與KOR、DOR或阿片孤兒受體(opioid receptor-like 1 receptor, ORL1)共同瞬時轉(zhuǎn)染于HEK293細胞后,采用Co-IP實驗研究發(fā)現(xiàn),ABIN-1與上述三種阿片受體亞型存在相互作用；且與其他G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors, GPCR)如MrgD受體等也存在相互作用,但是ABIN-1對這些受體功能的影響還有待進一步研究。4、采用穩(wěn)定表達MOR (MOR-CHO)及共同穩(wěn)定表達MOR和ABIN-1 (MOR-ABIN-1-CHO)的細胞系,對ABIN-1調(diào)節(jié)MOR功能的分子機制進行了研究。ABIN-1過表達抑制DAMGO作用后MOR的磷酸化和泛素化,明顯延緩MOR脫磷酸化,且在mRNA水平上抑制GRK2及β-arrestin2的表達。5、MOR-CHO細胞和MOR-ABIN-1-CHO細胞分別用5μM DAMGO處理1-360 mmin。發(fā)現(xiàn)DAMGO處理20 min后過表達ABIN-1明顯抑制ERK磷酸化；處理40 min后,過表達ABIN-1對CREB磷酸化有顯著抑制作用；提示ABIN-1對MOR激活后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也有顯著抑制作用。結(jié)論ABIN-1與MOR在過表達細胞系、SH-SY5Y細胞及大鼠腦組織存在相互作用,且激動劑慢性作用后能促進兩者間相互作用；ABIN-1與其他阿片受體亞型也存在相互作用,提示ABIN-1不是MOR的特異性相互作用蛋白,對其他受體功能可能也具有調(diào)節(jié)作用。ABIN-1與MOR相互作用后能夠抑制DAMGO作用后的MOR磷酸化和泛素化,且明顯延緩MOR脫磷酸化。這些結(jié)果提示,ABIN-1與MOR相互作用后能負性調(diào)控MOR的功能,其對阿片成癮的影響有待進一步研究。
【關(guān)鍵詞】：ABIN-1 MOR 泛素化 磷酸化 ERK磷酸化 CREB磷酸化
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 個人簡歷3-6
• 摘要6-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-22
• 第一章 ABIN-1與MOR相互作用及其特異性的驗證22-46
• 1 實驗材料22-27
• 2 實驗方法27-33
• 3 實驗結(jié)果33-45
• 3.1 ABIN-1與MOR相互作用的驗證33-35
• 3.2 在SH-SY5Y細胞中驗證ABIN-1與MOR相互作用35-38
• 3.3 在大鼠腦組織中ABIN-1與MOR的相互作用38-40
• 3.4 ABIN-1與其他阿片受體及非阿片受體的相互作用40-45
• 4 小結(jié)45-46
• 第二章 ABIN-1對MOR功能的調(diào)節(jié)機制研究46-67
• 1 實驗材料46-49
• 2 實驗方法49-52
• 3 數(shù)據(jù)處理52
• 4 實驗結(jié)果52-66
• 4.1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞中MOR及蛋白ABIN-1的表達52-54
• 4.2 ABIN-1對MOR功能的調(diào)節(jié)機制54-63
• 4.3 ABIN-1對MOR激活后受體后信號分子的影響63-66
• 5 小結(jié)66-67
• 討論67-73
• 結(jié)論73-74
• 參考文獻74-84
• 附錄184-87
• 綜述87-105
• 參考文獻100-105
• 致謝105-107
• 碩士期間(待)發(fā)表的文章107-108
• 附件108-115

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 方芳,汪青,曹清,劉景生;嗎啡依賴小鼠腦組織cAMP系統(tǒng)的變化及腺苷酸環(huán)化酶磷酸化調(diào)節(jié)[J];中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報;2000年01期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 王蕭;蛋白ABIN1與μ阿片受體的作用及其功能影響研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2011年

2 趙鈞如;ABIN1與μ阿片受體功能的相互調(diào)節(jié)[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2013年

  本文關(guān)鍵詞：ABIN-1對MOR功能的調(diào)節(jié)機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：360920