發(fā)布時間：2017-05-09 15:08

  本文關(guān)鍵詞：重組大腸桿菌中1,2,4-丁三醇合成途徑的構(gòu)建和優(yōu)化，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：1,2,4-丁三醇(1,2,4-butanetriol,簡稱BT)是一種重要的非天然多元醇,在醫(yī)藥、軍工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值。醫(yī)藥方面,丁三醇可被用作陽離子脂質(zhì)體和多種手性藥物的合成前體。丁三醇最有潛力的應(yīng)用是作為1,2,4-丁三醇三硝酸酯(1,2,4-butanetriol trinitrate,BTTN)的合成前體,后者可代替硝化甘油作為推進劑和含能增塑劑,并具有更優(yōu)的理化性質(zhì)。此外,丁三醇還可用于合成聚氨酯泡沫、卷煙添加劑和彩色顯影劑,等等。目前1,2,4-丁三醇的商業(yè)生產(chǎn)多采用化學(xué)合成法,存在反應(yīng)條件苛刻、環(huán)境污染嚴重、生產(chǎn)危險性大、副產(chǎn)物多等弊端。近年來,越來越多的人將目光投向了利用成本低廉的原料,以反應(yīng)條件溫和、對環(huán)境友好且安全高效的生物合成法。目前已有研究者成功建立了用大腸桿菌轉(zhuǎn)化木糖生產(chǎn)1,2,4-丁三醇的菌株和工藝。但從已有報道來看,用重組E.coli轉(zhuǎn)化木糖生產(chǎn)丁三醇的催化效率較低,這導(dǎo)致丁三醇產(chǎn)量遠無法滿足工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的需求。如果要進一步提高1,2,4-丁三醇的轉(zhuǎn)化效率,首先必須對丁三醇的合成途徑進行系統(tǒng)的優(yōu)化,找出催化限速步驟,精確調(diào)節(jié)催化各個步驟酶的表達量,以實現(xiàn)最大的轉(zhuǎn)化通量。本文首先通過yag E、yjh H、yia E、ycd W和xyl AB等旁路基因的敲除,以及來自新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)的D-木糖脫氫酶的編碼基因xdh和來自惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的苯甲酰甲酸脫羧酶編碼基因mdl C在E.coli BW25113中的異源表達,成功構(gòu)建了能夠利用D-木糖合成0.30 g/L 1,2,4-丁三醇的重組菌株BW-011。為提高1,2,4-丁三醇的產(chǎn)量,我們分析了此合成途徑的限速步驟,并針對途徑中的第三步——3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸脫羧反應(yīng)進行了新的不同來源2-酮酸脫羧酶的篩選和表達。搖瓶轉(zhuǎn)化結(jié)果顯示,對于上述目標(biāo)反應(yīng),來自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的α-酮異戊酸脫羧酶(Kiv D)具有比Mdl C有更高的催化效率,表達Kiv D的重組菌株BW-025的丁三醇產(chǎn)量也達到了BW-011的3倍。之后我們對Kiv D進行了理性設(shè)計,旨在進一步提高Kiv D對目標(biāo)反應(yīng)的催化活性。與此同時,我們分別調(diào)節(jié)了BW-025的1,2,4-丁三醇合成途徑中各個步驟酶的表達量,以實現(xiàn)途徑轉(zhuǎn)化通量的提高,并發(fā)掘途徑中新的限速步驟。通過誘導(dǎo)型過表達xdh,我們最終獲得了1,2,4-丁三醇產(chǎn)量較BW-025提高了48.62%的重組菌株BW-074。此外,本文還探究了不同轉(zhuǎn)化條件對重組菌株1,2,4-丁三醇合成的影響。通過對培養(yǎng)基、溫度、初始菌量、p H和供氧等轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化,BW-025轉(zhuǎn)化72 h丁三醇的最高產(chǎn)量被提升至2.38 g/L。通過以上工作,本研究顯著提高了重組菌株利用木糖合成1,2,4-丁三醇的效率,并為之后生物法合成丁三醇的工作奠定了基礎(chǔ)并提供了一種方向。
【關(guān)鍵詞】：D-木糖 1 2 4-丁三醇 大腸桿菌 2-酮酸脫羧酶 理性設(shè)計 途徑優(yōu)化
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R914.5
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 第一章 緒論7-13
• 1.1 1,2,4-丁三醇7-10
• 1.1.1 1,2,4-丁三醇的理化性質(zhì)7
• 1.1.2 1,2,4-丁三醇的用途7
• 1.1.3 1,2,4-丁三醇的化學(xué)法合成7-8
• 1.1.4 1,2,4-丁三醇的生物法合成8-10
• 1.2 代謝工程10
• 1.3 研究意義及主要研究內(nèi)容10-13
• 1.3.1 研究意義10-11
• 1.3.2 研究內(nèi)容11-13
• 第二章 大腸桿菌中 1,2,4-丁三醇合成途徑的初步構(gòu)建和表達13-35
• 2.1 實驗材料14-16
• 2.1.1 質(zhì)粒和菌株14
• 2.1.2 引物14-15
• 2.1.3 培養(yǎng)基15-16
• 2.1.4 酶與試劑16
• 2.2 實驗方法16-27
• 2.2.1 常規(guī)分子實驗操作16-20
• 2.2.2 BW-004的構(gòu)建20-22
• 2.2.3 BW-010的構(gòu)建22-25
• 2.2.4 重組大腸桿菌BW-011的構(gòu)建25-26
• 2.2.5 菌株的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化26-27
• 2.2.6 代謝產(chǎn)物的檢測分析27
• 2.3 實驗結(jié)果27-33
• 2.3.1 BW-004的構(gòu)建27-30
• 2.3.2 BW-010的構(gòu)建30-31
• 2.3.3 BW-011的構(gòu)建31-32
• 2.3.4 BW-011的搖瓶轉(zhuǎn)化32-33
• 2.4 本章小結(jié)33-35
• 第三章 大腸桿菌合成 1,2,4-丁三醇的途徑優(yōu)化35-53
• 3.1 實驗材料35-37
• 3.1.1 質(zhì)粒和菌株35
• 3.1.2 引物35-36
• 3.1.3 培養(yǎng)基36-37
• 3.1.4 酶與試劑37
• 3.2 實驗方法37-43
• 3.2.1 對新 2-酮酸脫羧酶的篩選37
• 3.2.2 KivD的理性設(shè)計37
• 3.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建37-42
• 3.2.4 重組菌株的構(gòu)建42
• 3.2.5 質(zhì)粒的化學(xué)轉(zhuǎn)化42
• 3.2.6 菌株的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化42-43
• 3.3 實驗結(jié)果43-50
• 3.3.1 對新 2-酮酸脫羧酶的篩選43
• 3.3.2 KivD的理性設(shè)計43-49
• 3.3.3 1,2,4-丁三醇合成途徑中各步酶的表達量的精確調(diào)節(jié)49-50
• 3.4 本章小結(jié)50-53
• 第四章 轉(zhuǎn)化條件對 1,2,4-丁三醇合成的影響53-64
• 4.1 實驗材料53
• 4.1.1 菌株53
• 4.1.2 培養(yǎng)基53
• 4.1.3 試劑53
• 4.2 實驗方法53-55
• 4.2.1 菌株的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化53-54
• 4.2.2 代謝產(chǎn)物的檢測分析54
• 4.2.3 菌株生長情況分析54
• 4.2.4 SDS-PAGE54-55
• 4.3 實驗結(jié)果55-63
• 4.3.1 不同轉(zhuǎn)化體系對 1,2,4-丁三醇合成的影響55-57
• 4.3.2 不同轉(zhuǎn)化條件對 1,2,4-丁三醇合成的影響57-62
• 4.3.3 優(yōu)化條件下的 1,2,4-丁三醇合成情況62-63
• 4.4 本章小結(jié)63-64
• 主要結(jié)論與展望64-66
• 主要結(jié)論64-65
• 展望65-66
• 致謝66-68
• 參考文獻68-72
• 附錄: 作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文72-73
• 附錄: 論文中主要基因序列73-81

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 田林祥;1,2,4-丁三醇的高效液相色譜分析[J];火炸藥學(xué)報;2001年02期

2 蔡征宇;王明亮;;(S)-3-羥基-γ-丁內(nèi)酯一步法合成(S)-1,2,4-丁三醇的研究[J];合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2010年06期

3 徐松林;陽世清;;國外含能材料的生物合成研究進展[J];化學(xué)通報;2007年08期

4 金銳;;同源重組的好工具,Red重組系統(tǒng)[J];科教文匯(下旬刊);2007年10期

5 李赤峰,徐保國;1,2,4-丁三醇合成工藝述評[J];湖南化工;2000年03期

6 于慧敏;馬玉超;;工業(yè)微生物代謝途徑調(diào)控的基因敲除策略[J];生物工程學(xué)報;2010年09期

7 任力強;Ras蛋白異戊二烯化修飾與抗癌藥物的設(shè)計[J];生命的化學(xué)(中國生物化學(xué)會通訊);1994年02期

8 韓聰,張惟材,游松;Red同源重組技術(shù)研究進展[J];中國生物工程雜志;2003年12期

9 趙學(xué)明,王靖宇,陳濤,陳洵,班睿,馬紅武;后基因組時代的代謝工程:機遇與挑戰(zhàn)[J];生物加工過程;2004年02期

10 楊多;銀屑病的藥物治療進展[J];天津藥學(xué);2000年04期

  本文關(guān)鍵詞：重組大腸桿菌中1,2,4-丁三醇合成途徑的構(gòu)建和優(yōu)化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：352707