本文關(guān)鍵詞：以熱休克蛋白為靶點(diǎn)的抗HBV藥物研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)是一種能通過反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行復(fù)制的小分子DNA病毒,它能感染宿主引起乙型病毒性肝炎(Hepatitis B)疾病。HBV感染是世界性的公共健康問題,慢性感染會導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化和肝癌。目前,臨床上治療慢性乙病毒性肝炎的方式主要有兩種:干擾素α的注射和核苷(酸)類似物如恩替卡韋、拉米夫定、阿地福韋等藥物的服用,但是這兩種方式都存在一些不足,如高劑量干擾素α存在宿主應(yīng)答率低、副作用大等缺點(diǎn),而核苷(酸)類似物藥物容易引起耐藥性及停藥反彈等缺點(diǎn),所以急需尋找新型的抗乙型肝炎病毒藥物。熱休克蛋白(Heat-shock proteins,HSPs)是細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的一種伴侶蛋白,在HBV復(fù)制過程中,對反轉(zhuǎn)錄酶(P蛋白)與前基因組RNA上的RNA包裝信號(ε)的相互作用至關(guān)重要。KNK437能夠通過影響熱休克因子HSF和HSE的相互作用,來抑制熱休克蛋白的mRNA和蛋白的積累,以及影響熱休克蛋白在HeLa細(xì)胞、結(jié)腸癌、鱗狀細(xì)胞癌和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的培養(yǎng)細(xì)胞中誘導(dǎo)耐熱功能。而且KNK437還能在桿狀病毒感染周期中,抑制病毒顆粒的產(chǎn)生。但KNK437對乙肝病毒是否產(chǎn)生抑制作用,依然未知。本研究主要運(yùn)用了三種肝癌細(xì)胞系模型:HepG2.215細(xì)胞系、瞬時轉(zhuǎn)染1.1×HBV(pCH9-3091)質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞系和1.3×HBV(pGEM-1.3×HBV)質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞系。適當(dāng)濃度的KNK437處理細(xì)胞后,用CCK-8的方法測定了藥物的細(xì)胞毒性、酶聯(lián)免疫法檢測了表面抗原HBsAg和HBeAg的分泌、熒光定量PCR的方法檢測了細(xì)胞內(nèi)HBV DNA和RNA水平的變化,最后還檢測了KNK437對熱休克蛋白的影響。研究結(jié)果表明20μM KNK437對細(xì)胞沒有毒性,且在該濃度下KNK437能夠抑制HBV HBsAg和HBeAg的分泌,并且能夠大幅度下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HBV DNA和RNA水平,抑制HBV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,實(shí)驗(yàn)也表明KNK437能夠抑制熱休克蛋白的表達(dá)。本研究說明KNK437能夠在細(xì)胞水平抑制HBV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,以及抗原蛋白的表達(dá)。核苷(酸)類似物藥物作用機(jī)制都發(fā)生在HBV復(fù)制階段,長期用藥后容易發(fā)生突變。與其不同的是KNK437的作用靶點(diǎn)是細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白而非病毒本身,它可能作為一種新穎的靶向熱休克蛋白的抗乙型肝炎病毒藥物,具有較高的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：乙型肝炎病毒(HBV) 熱休克蛋白(HSPs) KNK437 肝癌細(xì)胞系 抑制作用
【學(xué)位授予單位】：湖北工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R978.7
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第1章 引言9-23
• 1.1 HBV的概述9-13
• 1.1.1 HBV的分類學(xué)及基因分型9-10
• 1.1.2 HBV的結(jié)構(gòu)和形態(tài)10-11
• 1.1.3 HBV基因組結(jié)構(gòu)及蛋白產(chǎn)物11-13
• 1.2 HBV的生活周期13-17
• 1.2.1 病毒入侵宿主細(xì)胞14-15
• 1.2.2 雙股DNA形成cccDNA15
• 1.2.3 病毒的轉(zhuǎn)錄與翻譯15-16
• 1.2.4 核衣殼的組裝與反轉(zhuǎn)錄16-17
• 1.2.5 病毒的分泌與釋放17
• 1.3 乙型肝炎的治療17-19
• 1.3.1 干擾素17-18
• 1.3.2 核苷（酸）類似物18-19
• 1.4 熱休克蛋白19-20
• 1.4.1 熱休克蛋白概述19-20
• 1.4.2 熱休克蛋白與HBV反轉(zhuǎn)錄的作用20
• 1.5 KNK43720-22
• 1.5.1 KNK437概述20-21
• 1.5.2 KNK437生物功能21-22
• 1.6 本研究的目的、意義22-23
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料及方法23-42
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-31
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和質(zhì)粒23-24
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材24-27
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器27-28
• 2.1.4 培養(yǎng)基及生化試劑的配制28-31
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法31-42
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理31
• 2.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染31-32
• 2.2.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)32
• 2.2.4 細(xì)胞凍存32-33
• 2.2.5 膠原包被33
• 2.2.6 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備33
• 2.2.7 質(zhì)粒DNA向大腸桿菌中轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒提取33-34
• 2.2.8 ELISA檢測細(xì)胞上清中HBsAg/HBeAg水平34-35
• 2.2.9 Bradford法測定蛋白濃度35-36
• 2.2.10 細(xì)胞內(nèi)DNA提取36-37
• 2.2.11 SDS-PAGE37
• 2.2.12 Western Blot37-38
• 2.2.13 RNA的提取38
• 2.2.14 反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)38-39
• 2.2.15 熒光定量39-40
• 2.2.16 統(tǒng)計(jì)性分析40
• 2.2.17 實(shí)時定量PCR引物表40-42
• 第3章 結(jié)果與分析42-70
• 3.1 KNK437對HepG2.215細(xì)胞系和Huh7細(xì)胞系的細(xì)胞毒性42-44
• 3.1.1 KNK437對HepG2.215細(xì)胞系的細(xì)胞毒性42-43
• 3.1.2 KNK437對Huh7細(xì)胞系的細(xì)胞毒性43-44
• 3.1.3 小結(jié)44
• 3.2 KNK437對HBV的HBsAg和HBeAg水平的影響44-54
• 3.2.1 KNK437的濃度梯度處理后對HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響45-49
• 3.2.2 KNK437的時間梯度處理后對HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響49-54
• 3.2.3 小結(jié)54
• 3.3 KNK437對HBV DNA復(fù)制的影響54-60
• 3.3.1 KNK437的濃度梯度處理后對HBV DNA復(fù)制的影響55-57
• 3.3.2 KNK437的時間梯度處理后對HBV DNA復(fù)制的影響57-60
• 3.3.3 小結(jié)60
• 3.4 KNK437對HBV轉(zhuǎn)錄的影響60-65
• 3.4.1 KNK437的濃度梯度處理后對HBV RNA水平的影響60-63
• 3.4.2 KNK437的時間梯度處理后對HBV RNA復(fù)制的影響63-65
• 3.4.3 小結(jié)65
• 3.5 KNK437對熱休克蛋白的轉(zhuǎn)錄的影響65-70
• 3.5.1 用熒光定量PCR檢測KNK437對hsp70轉(zhuǎn)錄的影響66-67
• 3.5.2 用熒光定量PCR檢測KNK437對hsp90b轉(zhuǎn)錄的影響67
• 3.5.3 用熒光定量PCR檢測KNK437對hsp40轉(zhuǎn)錄的影響67-68
• 3.5.4 小結(jié)68-70
• 第4章 討論70-73
• 參考文獻(xiàn)73-81
• 致謝81-82
• 作者簡歷82

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