本文關鍵詞：喜樹堿對小鼠皮層神經元神經毒性的機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：喜樹堿(Camptothecin, CPT)是公認的有效抗腫瘤藥,藥理研究證實,喜樹堿主要是抑制腫瘤細胞在DNA復制過程中拓撲異構酶Ⅰ(topoisomerase I, Topo-Ⅰ)的活性而發(fā)揮抗腫瘤作用,即主要在細胞周期S期起作用。神經元是高度分化的細胞,細胞無分裂增殖能力,不存在DNA復制過程,即細胞周期只停留在G1期,因此,理論上喜樹堿對神經元是無細胞毒性作用。然而,不斷有臨床報道,喜樹堿具有一定的神經系統毒副作用。惡性腫瘤病人在化療期間或化療后常出現神經系統癥狀,如一過性構音障礙、肢體的共濟失調等,特別是長期接受化療患者更易發(fā)生。目前喜樹堿對神經系統損傷的具體機制尚不明確。神經元雖是高度分化的細胞,但大腦常處于高氧的環(huán)境。因此,神經元中DNA轉錄的發(fā)生較其他細胞更為活躍。喜樹堿的神經毒性機制是否與DNA的轉錄過程有關,喜樹堿是否會通過抑制轉錄過程中Topo-Ⅰ活性,引起DNA單鏈斷裂,大量單鏈斷裂DNA的積累,影響了整個DNA的穩(wěn)定,最終導致DNA雙鏈斷裂,造成神經元凋亡。為此,本實驗利用原代培養(yǎng)小鼠神經元,觀察喜樹堿及加轉錄抑制劑干預后神經元的DNA損傷以及凋亡的誘導作用,以期深入揭示喜樹堿中樞神經毒性的內在機制。目的：本實驗以原代培養(yǎng)小鼠大腦皮層神經元為切入點,觀察喜樹堿對神經元活性及凋亡的影響,以期對喜樹堿的神經毒性機制進行科學詮釋,為該中藥更好應用于臨床提供實驗依據。方法：1.采用原代取材方法獲得小鼠大腦皮層神經細胞,進行培養(yǎng),純化。2.篩選喜樹堿的用藥濃度。將培養(yǎng)的神經元分為7組,分別加入不同濃度的喜樹堿,終濃度分別為0、2.5、5、10、20、40、80UM,每個濃度設6個復孔,分別培養(yǎng)至12h、24h、48h后,采用CCK-8方法檢測細胞的活性。并計算喜樹堿的半數抑制濃度(IC50),作為后續(xù)實驗用藥濃度。3.觀察喜樹堿對神經元活性及凋亡的影響：培養(yǎng)至7天左右的神經元,分別設3組：正常組、喜樹堿組、喜樹堿聯合DRB(轉錄抑制劑)組。正常組神經元不做任何處理,喜樹堿組加入41.8UM喜樹堿(前期實驗篩選出的IC50濃度),喜樹堿聯合DRB組加入41.8UM喜樹堿和10UM DRB (常規(guī)用藥濃度),干預24h后,CCK-8檢測各組神經元活性變化,然后通過TUNEL染色法、γ-H2AX免疫熒光標記、流式細胞法,檢測神經元DNA損傷及凋亡情況。結果：1.確定了喜樹堿的用藥濃度(ICso)和時間為：41.8UM喜樹堿作用24h。2.明確了喜樹堿抑制神經元活性的量效、時效關系：不同濃度喜樹堿作用于神經元后,各組細胞活性的結果：12h時間點,與正常對照組比較,各用藥組OD值均下降,2.5UM組細胞活性下降不明顯,5UM組細胞活性顯著降低(P0.01),隨著喜樹堿濃度的增加,細胞活性下降更為顯著。24h、48h時間點,與正常對照組比較,各用藥組細胞OD值均顯著下降(P0.01,P0.001),且隨著濃度的增加,細胞活性下降愈顯著。另一方面,同一濃度下,隨著給藥時間的延長,細胞活性下降越明顯。3.喜樹堿對神經元活性的影響：與正常對照組比較,喜樹堿組OD值明顯下降(P0.001),提示喜樹堿可顯著抑制神經元的活性；與喜樹堿組比較,喜樹堿聯合DRB組OD值升高(P0.001),提示加入轉錄抑制劑DRB后,喜樹堿對神經元活性的抑制作用明顯下降。4.喜樹堿對神經元γ-H2AX表達的影響：正常組神經元幾乎看不到綠色熒光,提示正常組神經元7-H2AX陰性表達。喜樹堿組神經元γ-H2AX的表達明顯增多,綠色熒光顆粒主要分布在神經元的細胞核中,提示該組部分神經元出現了DNA損傷,加入轉錄抑制劑神經元組γ-H2AX的表達較喜樹堿組神經元明顯減少,提示加轉錄抑制劑作用后能減少神經元DNA損傷。5.三組神經元TUNEL染色結果：正常組神經元的細胞核較圓且規(guī)整,看不到熒光顆粒；喜樹堿組神經元,細胞核形狀變得不規(guī)則,胞核區(qū)標記有強弱不等的綠色熒光顆粒,且陽性著色的神經元比例明顯增多,加轉錄抑制劑組神經元,細胞核形狀不規(guī)則,陽性著色的綠色熒光顆粒較喜樹堿組明顯減少。6.流式細胞儀檢測結果：與正常對照組比較,喜樹堿組正常細胞百分比明顯降低(2.9%),早期凋亡、晚期凋亡細胞百分比明顯增多,分別達到40.1%、56.8%。與喜樹堿組比較,加抑制劑組晚期凋亡百分比明顯降低(15.3%),正常細胞百分比明顯增多(12.0%)。結論：1.喜樹堿對培養(yǎng)的原代小鼠皮層神經元活性具有較明顯的抑制作用,且呈明顯的濃度及時間依賴性。2.喜樹堿可明顯抑制神經元活性,引起神經元發(fā)生DNA損傷,乃至凋亡。結果證實了喜樹堿具有神經元毒性作用。3.轉錄抑制劑DRB可有效減輕喜樹堿誘導的神經元損傷和凋亡,提示喜樹堿的神經元毒性機制可能與轉錄環(huán)節(jié)有關。
【關鍵詞】：DNA轉錄 DNA損傷 神經毒性 小鼠皮層神經元 喜樹堿 細胞凋亡
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R965
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 英文縮略詞10-11
• 上篇 文獻綜述11-29
• 綜述一 喜樹堿的藥理作用及毒性的研究進展11-19
• 1 喜樹堿的化學結構11
• 2 喜樹堿的藥理作用及機制11-13
• 2.1 喜樹堿的抗腫瘤作用11-12
• 2.2 喜樹堿的抗病毒作用12-13
• 3 喜樹堿的毒副作用及其機制研究13-15
• 3.1 喜樹堿毒副作用的相關臨床研究報道13
• 3.2 喜樹堿的免疫抑制作用及其機制研究13-14
• 3.3 喜樹堿的神經毒性作用及其機制研究14-15
• 4 小結15-16
• 參考文獻16-19
• 綜述二 DNA拓撲異構酶及其抑制劑的研究進展19-29
• 1 拓撲異構酶的結構及其生物學功能19-20
• 1.1 拓撲異構酶的結構19
• 1.2 拓撲異構酶的生物學功能19-20
• 2 拓撲異構酶的DNA調控及修復作用機制20-21
• 2.1 DNA超螺旋結構的調控20-21
• 2.2 拓撲異構酶對DNA修復作用21
• 3 拓撲異構酶抑制劑21-24
• 3.1 拓撲異構酶抑制劑的作用原理22
• 3.2 有機小分子類拓撲異構酶抑制劑22-23
• 3.3 金屬類小分子拓撲異構酶抑制劑23-24
• 4 小結24-25
• 參考文獻25-29
• 下篇 實驗研究29-45
• 前言29-30
• 實驗一：小鼠皮層神經元的鑒定和喜樹堿用藥濃度的篩選30-38
• 材料與方法30-34
• 1 實驗材料30-31
• 2 實驗方法31-34
• 實驗結果34-35
• 1 原代培養(yǎng)小鼠皮層神經元的觀察34
• 2 喜樹堿抑制神經元活性的量效、時效關系34-35
• 討論35-37
• 參考文獻37-38
• 實驗二：從轉錄環(huán)節(jié)研究喜樹堿誘導神經元凋亡的內在機制38-45
• 材料與方法38-40
• 1 實驗材料38
• 2 實檢方法38-40
• 實驗結果40-42
• 1 各組神經元活性的變化40-41
• 2 各組神經元γ-H_2AX的表達情況41
• 3 各組神經元TUNEL染色結果41
• 4 流式細胞儀檢測結果41-42
• 討論及展望42-44
• 參考文獻44-45
• 結語45-46
• 附圖46-49
• 致謝49-50
• 個人簡歷50-51

【參考文獻】

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本文編號：350059