本文關(guān)鍵詞：共載鹽霉素和氯喹的納米脂質(zhì)體體外抗肝癌細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞的作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：我國(guó)是肝癌發(fā)病率較高的國(guó)家,目前對(duì)其尚缺乏有效的治療手段,因此,迫切需要尋找一種有效的治療方案。而肝癌干細(xì)胞(LCSCs)被認(rèn)為是肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的主要原因,因此消除LCSCs對(duì)于肝癌的治療至關(guān)重要。最近研究發(fā)現(xiàn),鹽霉素(SAL)對(duì)多種腫瘤干細(xì)胞(CSCs)具有殺傷作用,而且在體內(nèi)和體外均能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。因此,本課題首先選用SAL作為殺傷LCSCs的化療藥物。然而,研究表明腫瘤中的非CSCs可以自發(fā)和隨機(jī)地變成CSCs,這就嚴(yán)重降低了只靶向CSCs治療策略的治療效果。因此,對(duì)于癌癥的治療,需要同時(shí)消除CSCs和非CSCs才能達(dá)到良好的治療效果。最近,聯(lián)合治療被認(rèn)為是治療腫瘤的有效方法。目前,已經(jīng)有大量報(bào)道證明自噬抑制劑與化療藥物聯(lián)用可以有效治療腫瘤。因此,本課題將SAL與自噬抑制劑氯喹(CQ)聯(lián)用,在SAL殺傷LCSCs的同時(shí),通過(guò)CQ抑制自噬的作用增強(qiáng)SAL殺傷肝癌細(xì)胞的作用。另外,將SAL與CQ聯(lián)用還可以降低SAL的用量,從而減少其毒副作用。然而,兩種藥物聯(lián)用可以產(chǎn)生三種作用,即協(xié)同作用,相加作用和拮抗作用。因此,我們需要對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化,得到兩者聯(lián)用的最佳協(xié)同比例。但由于不同的藥物具有不同的藥代動(dòng)力學(xué)特性,因此游離藥物可能無(wú)法維持協(xié)同比例到達(dá)腫瘤部位,這就需要通過(guò)藥物遞送系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。而研究表明,共遞送系統(tǒng)比單獨(dú)的藥物遞送系統(tǒng)表現(xiàn)出更好的治療效果。更重要的是,有證據(jù)表明,對(duì)于癌癥的治療,共遞送兩種藥物會(huì)產(chǎn)生協(xié)同作用,而兩個(gè)單獨(dú)遞藥系統(tǒng)的簡(jiǎn)單物理混合物則不會(huì)有這種效果。因此,我們將SAL和CQ以協(xié)同比例共包載于同一納米脂質(zhì)體中,不僅增強(qiáng)了抗腫瘤的效果,而且進(jìn)一步降低了SAL的毒性。本文的第一部分首先采用懸浮球培養(yǎng)方法從HepG2細(xì)胞中分離出具有干細(xì)胞特性的微球體,簡(jiǎn)稱(chēng)為HepG2-TS。然后,分別考察了SAL和CQ對(duì)HepG2細(xì)胞和HepG2-TS的殺傷作用,并得到了各自的IC50值。其中SAL對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50=5.200±0.719μM,對(duì)HepG2-TS的IC50=0.321±0.079μM;CQ對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50=10.531±1.322μM,對(duì)HepG2-TS的IC50=18.687±3.018μM。說(shuō)明SAL對(duì)HepG2-TS具有更強(qiáng)的殺傷作用。最后,考察了兩者聯(lián)用時(shí)在不同濃度和不同比例的條件下,對(duì)HepG2細(xì)胞和HepG2-TS的殺傷作用,從而確定了兩者聯(lián)用的最佳協(xié)同比例,即SAL:CQ=1:5(mol/mol)。第二部分建立了SAL和CQ的體外含量測(cè)定方法并對(duì)其進(jìn)行了方法學(xué)考察。結(jié)果顯示,SAL在10~1280μg/m L的濃度范圍內(nèi),與峰面積呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為A=1028C-661.1(R2=1)。CQ在5~320μg/mL的濃度范圍內(nèi),與峰面積呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為A=38435C-46890(R2=0.9999)。且所建立的SAL和CQ的體外含量測(cè)定方法具有特異性,精密度和準(zhǔn)確度均符合要求,因此,本課題接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)均采用該方法作為藥物含量的測(cè)定方法。第三部分以氫化大豆卵磷脂(HSPC)、膽固醇和DSPE-PEG2000為材料,摩爾比為85:10:5,采用乙醇注入法和硫酸銨梯度法分別制備了空白納米脂質(zhì)體(NL)、載SAL的納米脂質(zhì)體(SNL)、載CQ的納米脂質(zhì)體(CNL)和共包載SAL和CQ的納米脂質(zhì)體(SCNL)。所得納米脂質(zhì)體的粒徑為120 nm左右,分散均勻,形態(tài)圓整,zeta電位為-13.7~-17.1 mV。SNL中SAL的包封率(EE)約為70%,載藥量(DL)約為3%;CNL中CQ的EE約為70%,DL約為10%;SCNL中SAL和CQ的EE和DL與SNL和CNL基本一致,且二者的摩爾比約為1:5。第四部分對(duì)藥物和納米脂質(zhì)體在體外抗HepG2細(xì)胞和HepG2-TS的活性進(jìn)行了研究。分別采用CCK-8法考察細(xì)胞毒性,Annexin V-FITC/PI雙染法考察細(xì)胞凋亡的情況,以及克隆形成實(shí)驗(yàn)考察HepG2細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果表明,SAL和CQ以協(xié)同比例聯(lián)用可以顯著提高對(duì)HepG2細(xì)胞的殺傷作用,誘導(dǎo)凋亡的能力和抑制增殖的能力,而對(duì)于HepG2-TS則沒(méi)有明顯的增強(qiáng)作用。另外,SNL和CNL聯(lián)用組及SCNL組在HepG2細(xì)胞中都表現(xiàn)出最強(qiáng)的殺傷作用,誘導(dǎo)凋亡的能力和抑制增殖的能力,而在HepG2-TS中雖然不像在Hep G2細(xì)胞中那樣具有明顯的增強(qiáng)作用,但也同樣具有較強(qiáng)的殺傷作用和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力,且這兩者之間抗HepG2細(xì)胞和HepG2-TS的作用沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第五部分我們首先采用Western-Blot考察了HepG2細(xì)胞和HepG2-TS的基本自噬水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HepG2細(xì)胞的基本自噬水平比HepG2-TS高。接著,我們又考察了不同處理組(即SAL、CQ、SAL+CQ、NL、SNL、CNL、SNL+CNL和SCNL)對(duì)HepG2細(xì)胞和HepG2-TS基本自噬水平的影響,發(fā)現(xiàn)在HepG2細(xì)胞中,各處理組都具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)基本自噬水平下降的作用,而在HepG2-TS中則沒(méi)有這種作用。這就解釋了第四部分的結(jié)果,即由于HepG2細(xì)胞的基本自噬水平高,而自噬對(duì)于腫瘤細(xì)胞是一種保護(hù)作用,因此,當(dāng)SAL與自噬抑制劑CQ聯(lián)用后,可以通過(guò)抑制HepG2細(xì)胞的自噬水平增強(qiáng)對(duì)其抗腫瘤活性,而HepG2-TS由于基本自噬水平較低,所以抑制自噬并不能增強(qiáng)對(duì)其抗腫瘤活性。綜上所述,SCNL在體外具有較強(qiáng)的抗肝癌細(xì)胞和LCSCs的作用。另外,初步證明了CQ可以通過(guò)抑制自噬增強(qiáng)SAL對(duì)HepG2細(xì)胞的抗腫瘤活性。
【關(guān)鍵詞】：肝癌 鹽霉素 氯喹 協(xié)同作用 納米脂質(zhì)體 自噬
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R943;R96
【目錄】：

• 摘要9-11
• Abstract11-14
• 縮略詞表14-15
• 前言15-18
• 第一章 SAL和CQ的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)18-30
• 一、儀器與試劑18-19
• （一） 儀器18
• （二） 試劑18-19
• （三） 細(xì)胞19
• 二、實(shí)驗(yàn)方法19-24
• （一） 肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)19-20
• （二） 肝癌干細(xì)胞的培養(yǎng)20-21
• （三） 細(xì)胞毒性21-23
• （四） 聯(lián)合效應(yīng)23-24
• 三、結(jié)果與討論24-28
• （一） HepG2細(xì)胞和HepG2-TS的生長(zhǎng)狀態(tài)24-25
• （二） 細(xì)胞毒性25-26
• （三） 聯(lián)合效應(yīng)26-28
• 四、小結(jié)28-30
• 第二章 SAL和CQ含量測(cè)定方法的建立30-39
• 一、儀器與試劑31-32
• （一） 儀器31
• （二） 試劑31-32
• 二、實(shí)驗(yàn)方法32-33
• （一） SAL體外HPLC定量分析方法的建立32-33
• （二） CQ體外HPLC定量分析方法的建立33
• 三、結(jié)果與討論33-38
• （一） SAL體外HPLC定量分析方法的建立33-36
• （二） CQ體外HPLC定量分析方法的建立36-38
• 四、小結(jié)38-39
• 第三章 納米脂質(zhì)體的制備及表征39-46
• 一、儀器與試劑39-40
• （一） 儀器39-40
• （二） 試劑40
• 二、實(shí)驗(yàn)方法40-42
• （一） 空白納米脂質(zhì)體（NL）的制備40-41
• （二） 載SAL的納米脂質(zhì)體（SNL）的制備41
• （三） 載CQ的納米脂質(zhì)體（CNL）的制備41
• （四） 共包載SAL和CQ的納米脂質(zhì)體（SCNL）的制備41
• （五） 納米脂質(zhì)體的表征41-42
• 三、結(jié)果與討論42-45
• （一） 納米脂質(zhì)體的粒徑和zeta電位42-43
• （二） 納米脂質(zhì)體的形態(tài)43-44
• （三） 載藥量（DL）、包封率（EE）44-45
• 四、小結(jié)45-46
• 第四章 體外抗肝癌細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞的活性研究46-62
• 一、儀器與試劑46-49
• （一） 儀器46-47
• （二） 試劑47-48
• （三） 細(xì)胞48-49
• 二、實(shí)驗(yàn)方法49-54
• （一） 細(xì)胞毒性49-51
• （二） 細(xì)胞凋亡51-53
• （三） 克隆形成實(shí)驗(yàn)53-54
• 三、結(jié)果與討論54-60
• （一） 細(xì)胞毒性54-56
• （二） 細(xì)胞凋亡56-59
• （三） 克隆形成實(shí)驗(yàn)59-60
• 四、小結(jié)60-62
• 第五章 SAL和CQ抗肝癌細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞的機(jī)制研究62-74
• 一、儀器與試劑62-65
• （一） 儀器62
• （二） 試劑62-64
• （三） 細(xì)胞64-65
• 二、實(shí)驗(yàn)方法65-70
• （一） HepG2細(xì)胞和HepG2-TS的基本自噬水平65-68
• （二） 聯(lián)合用藥對(duì)HepG2細(xì)胞和HepG2-TS自噬水平的影響68-70
• 三、結(jié)果與討論70-72
• （一） HepG2細(xì)胞和HepG2-TS的基本自噬水平70-71
• （二） 聯(lián)合用藥對(duì)HepG2細(xì)胞和HepG2-TS自噬水平的影響71-72
• 四、小結(jié)72-74
• 參考文獻(xiàn)74-80
• 鹽霉素：一種新型抗癌藥物（綜述）80-88
• 參考文獻(xiàn)85-88
• 碩士期間發(fā)表論文及參加科研工作情況88-89
• 致謝89

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 Caitlin A Schonewolf;Monal Mehta;Devora Schiff;Hao Wu;Bruce G Haffty;Vassiliki Karantza;Salma K Jabbour;;Autophagy inhibition by chloroquine sensitizes HT-29 colorectal cancer cells to concurrent chemoradiation[J];World Journal of Gastrointestinal Oncology;2014年03期

  本文關(guān)鍵詞：共載鹽霉素和氯喹的納米脂質(zhì)體體外抗肝癌細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：344578