本文關(guān)鍵詞：胰蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選、發(fā)酵優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：胰蛋白酶是一種重要的蛋白酶,在醫(yī)藥、皮革加工、食品工業(yè)及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值。目前市售胰蛋白酶仍以動物源為主,受到制備成本高、動物性病毒風(fēng)險以及宗教問題等因素制約,導(dǎo)致其應(yīng)用存在限制。微生物源胰蛋白酶可以有效解決上述問題,且微生物發(fā)酵生產(chǎn)胰蛋白酶具有生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量和酶活高、制備簡便等特點。然而,目前多數(shù)研究仍主要圍繞動物源胰蛋白酶展開,微生物胰蛋白酶的潛力還遠(yuǎn)未得到開發(fā)。本論文從某皮革廠采集樣品,以脫脂奶粉為唯一碳氮源初篩產(chǎn)蛋白酶的菌株,再通過搖瓶發(fā)酵復(fù)篩,結(jié)合特異性酶活檢測篩選獲得8株具有較高胰蛋白酶活性的菌株,并擇其中一株產(chǎn)酶達(dá)20 U·m L-1的菌株DMN6進(jìn)行后續(xù)研究。通過生理生化與16S r DNA分子鑒定,將該菌株鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。通過單因素實驗對菌株DMN6產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明,該菌株產(chǎn)胰蛋白酶的最優(yōu)條件為,玉米粉15 g·L-1,大豆蛋白胨15 g·L-1,磷酸氫二鉀7 g·L-1,磷酸二氫鉀3 g·L-1,三氯化鐵5 mmol·L-1,氯化鎂15 mmol·L-1,接種量為1%,37℃下培養(yǎng)84 h,優(yōu)化后的發(fā)酵酶活可達(dá)140 U·m L-1,相比優(yōu)化前提高了7倍。采用DEAE Sepharose FF陰離子交換層析和Superdex 75凝膠層析對發(fā)酵液中胰蛋白酶進(jìn)行分離純化,純化后胰蛋白酶回收率為24.5%,純化倍數(shù)為8.5倍,比酶活可達(dá)350.0 U·mg-1。SDS-PAGE分析顯示,其分子量為44 k Da。對純化后的胰蛋白酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征,結(jié)果表明,該酶的最適反應(yīng)溫度為65℃,最適p H為9.0,并表現(xiàn)出良好的溫度和p H適應(yīng)范圍。該酶在45℃下仍能保持85%以上的酶活,且具有良好的穩(wěn)定性,表明該酶在較低溫度的工業(yè)條件下具有較好前景。Ba2+在低濃度下對該胰蛋白酶活性有明顯的促進(jìn)作用,而其它多數(shù)金屬離子則表現(xiàn)出一定抑制作用。絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF可以強烈抑制該酶的活性,說明該酶為絲氨酸蛋白酶類。表面活性劑對酶具有一定抑制作用。以BAEE為底物測定其酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù),結(jié)果顯示Km和Vmax分別為0.75 mmol·L-1和184 U·m L-1。
【關(guān)鍵詞】：胰蛋白酶 地衣芽孢桿菌 篩菌 發(fā)酵優(yōu)化 酶學(xué)性質(zhì)
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R945
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 緒論8-15
• 1.1 蛋白酶概述8
• 1.1.1 蛋白酶8
• 1.1.2 蛋白酶的分類8
• 1.2 胰蛋白酶概述8-10
• 1.2.1 胰蛋白酶的發(fā)現(xiàn)與起源8-9
• 1.2.2 胰蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)9
• 1.2.3 胰蛋白酶的催化機制9-10
• 1.3 胰蛋白酶的應(yīng)用10-11
• 1.3.1 醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用10
• 1.3.2 皮革加工應(yīng)用10-11
• 1.3.3 食品工業(yè)應(yīng)用11
• 1.3.4 農(nóng)業(yè)應(yīng)用11
• 1.4 胰蛋白酶近期研究進(jìn)展11-12
• 1.4.1 酶的分離純化11-12
• 1.4.2 酶的基因工程研究12
• 1.4.3 酶的固定化12
• 1.5 微生物源胰蛋白酶12-13
• 1.5.1 真菌類12-13
• 1.5.2 細(xì)菌類13
• 1.6 研究意義與研究內(nèi)容13-15
• 1.6.1 研究意義13-14
• 1.6.2 研究內(nèi)容14-15
• 第二章 產(chǎn)胰蛋白酶菌株的篩選與鑒定15-28
• 2.1 實驗材料15-17
• 2.1.1 篩菌樣品來源15
• 2.1.2 培養(yǎng)基15-16
• 2.1.3 實驗試劑16-17
• 2.1.4 主要儀器及設(shè)備17
• 2.2 實驗方法17-22
• 2.2.1 產(chǎn)胰蛋白酶菌株的篩選17-18
• 2.2.2 產(chǎn)胰蛋白酶菌株的分子鑒定18-20
• 2.2.3 產(chǎn)胰蛋白酶菌株的形態(tài)及生理生化鑒定20-22
• 2.3 結(jié)果與討論22-27
• 2.3.1 產(chǎn)胰蛋白酶菌株的篩選22-24
• 2.3.2 產(chǎn)胰蛋白酶菌株的 16S rDNA分子鑒定及同源性分析24-25
• 2.3.3 菌株DMN6菌株形態(tài)特征與生理生化鑒定25-27
• 2.4 本章小結(jié)27-28
• 第三章 地衣芽孢桿菌DMN6胰蛋白酶的發(fā)酵條件優(yōu)化28-38
• 3.1 實驗材料28-29
• 3.1.1 培養(yǎng)基28
• 3.1.2 菌株28
• 3.1.3 實驗試劑28-29
• 3.1.4 主要儀器及設(shè)備29
• 3.2 實驗方法29-31
• 3.2.1 菌體生長及產(chǎn)酶曲線29
• 3.2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化29
• 3.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化29-30
• 3.2.4 中試試驗30-31
• 3.3 結(jié)果與討論31-37
• 3.3.1 菌體生長及產(chǎn)酶曲線31
• 3.3.2 發(fā)酵條件對產(chǎn)酶的影響31-33
• 3.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基成分對產(chǎn)酶的影響33-36
• 3.3.4 中試試驗結(jié)果36-37
• 3.4 本章小結(jié)37-38
• 第四章 胰蛋白酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)38-50
• 4.1 實驗材料38-39
• 4.1.1 培養(yǎng)基38
• 4.1.2 菌株38
• 4.1.3 實驗試劑38
• 4.1.4 主要儀器及設(shè)備38-39
• 4.2 實驗方法39-41
• 4.2.1 胰蛋白酶的純化39-40
• 4.2.2 BCA法測定蛋白質(zhì)濃度40
• 4.2.3 變性蛋白凝膠電泳（SDS-PAGE）40
• 4.2.4 胰蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)40-41
• 4.3 結(jié)果與討論41-48
• 4.3.1 胰蛋白酶的純化41-44
• 4.3.2 胰蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)44-48
• 4.4 本章小結(jié)48-50
• 主要結(jié)論50
• 展望50-52
• 致謝52-53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 附錄：作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文57

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：胰蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選、發(fā)酵優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：317931