發(fā)布時(shí)間：2017-04-20 04:02

  本文關(guān)鍵詞：DAXX對(duì)于VSMC增殖的影響及機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:證實(shí)DAXX可以通過PTEN/AKT信號(hào)通路,抑制VSMC增殖,為動(dòng)脈粥樣硬化性的血管病變提供新的理論依據(jù)。方法:將DAXX的過表達(dá)質(zhì)粒pc DNA3.1(+)-DAXX及DAXX的干擾質(zhì)粒si RNA-DAXX,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的VSMC中,RT-PCR、Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率;MTT檢測(cè)細(xì)胞活力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VSMC周期情況;構(gòu)建PTEN干擾質(zhì)粒si RNA-PTEN,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到DAXX穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,應(yīng)用Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PTEN、AKT、P-AKT蛋白表達(dá)情況,RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)PTEN m RNA表達(dá)情況。結(jié)果:RT-PCR、Western Blot結(jié)果顯示,與模型組比較,轉(zhuǎn)染pc DNA3.1(+)-DAXX組,DAXX表達(dá)明顯升高;而si RNA-DAXX轉(zhuǎn)染組,DAXX表達(dá)明顯降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明轉(zhuǎn)染效率達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。MTT結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞活性明顯升高,與模型組比較,轉(zhuǎn)染pc DNA3.1(+)-DAXX組,細(xì)胞增殖明顯受到抑制;而si RNA-DAXX組的細(xì)胞活性相對(duì)升高,細(xì)胞增殖明顯。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組比較,模型組S期細(xì)胞明顯增多,與模型組比較,轉(zhuǎn)染pc DNA3.1(+)-DAXX組,S期細(xì)胞含量明顯下降;而轉(zhuǎn)si-DAXX組呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。RT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pc DNA3.1(+)-DAXX組PTEN表達(dá)與模型組相比明顯升高,而si RNA-DAXX組的PTEN表達(dá)低于模型組;pc DNA3.1(+)-DAXX穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株瞬時(shí)轉(zhuǎn)染si RNA-PTEN后,PTEN表達(dá)較模型組明顯降低。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)pc DNA3.1(+)-DAXX組,PTEN蛋白表達(dá)明顯高于模型組,P-AKT表達(dá)降低;而轉(zhuǎn)si RNA-DAXX組,PTEN蛋白表達(dá)卻顯著低于模型組,P-AKT表達(dá)增加;pc DNA3.1(+)-DAXX穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株瞬時(shí)轉(zhuǎn)染si RNA-PTEN后,PTEN蛋白表達(dá)較模型組明顯降低,而p-AKT表達(dá)明顯增高。結(jié)論:DAXX可以明顯抑制10%FBS刺激的VSMC增殖;DAXX抑制VSMC增殖,可能與PTEN/AKT這條信號(hào)通路有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：DAXX VSMC PTEN AKT 細(xì)胞增殖
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 緒論12-14
• 第2章 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建14-30
• 2.1 引言14-15
• 2.2 主要儀器與材料15-17
• 2.2.1 儀器15-16
• 2.2.2 主要試劑16-17
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法17-19
• 2.3.1 主要溶液配制17-18
• 2.3.2 質(zhì)粒pcDNA3.1、pcDNA3.1(+)-DAXX、siRNA-DAXX、siRNA、siRNA-PTEN的擴(kuò)增與提取18-19
• 2.4 VSMC培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染19-20
• 2.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)19
• 2.4.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染VSMC19-20
• 2.5 RT-PCR檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株內(nèi)DAXX mRNA變化20-22
• 2.5.1 總RNA的提取20-21
• 2.5.2 RNA逆轉(zhuǎn)錄（cDNA的合成）21-22
• 2.5.3 PCR擴(kuò)增：22
• 2.5.4 PCR產(chǎn)物鑒定22
• 2.6 Western-blot 檢測(cè) DAXX 蛋白的表達(dá)22-26
• 2.6.1 VSMC蛋白提取22-23
• 2.6.2 蛋白含量測(cè)定23
• 2.6.3 進(jìn)行Western-blot實(shí)驗(yàn)23-26
• 2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法26
• 2.8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-28
• 2.8.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-DAXX、siRNA-DAXX對(duì)VSMC內(nèi)DAXX的mRNA、蛋白表達(dá)的影響26-28
• 2.9 小結(jié)28-30
• 第3章 DAXX對(duì)于VSMC增殖的影響30-36
• 3.1 引言30
• 3.2 儀器與材料30
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法30-32
• 3.3.1 主要溶液配制30-31
• 3.3.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞的活力31
• 3.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期31-32
• 3.4 結(jié)果32-34
• 3.4.1 MTT檢測(cè)DAXX對(duì)于VSMC增殖的影響32
• 3.4.2 DAXX對(duì)于VSMC周期的影響32-34
• 3.5 小結(jié)34-36
• 第4章 DAXX對(duì)于PTEN/AKT信號(hào)通路的影響36-50
• 4.1 DAXX對(duì)于PTEN表達(dá)的影響36-42
• 4.1.1 引言36
• 4.1.2 儀器與材料36-37
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)方法37-39
• 4.1.4 結(jié)果39-41
• 4.1.5 小結(jié)41-42
• 4.2 DAXX對(duì)于AKT表達(dá)的影響42-50
• 4.2.1 引言42
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)方法42-43
• 4.2.3 結(jié)果43-47
• 4.2.4 小結(jié)47-50
• 第5章 實(shí)驗(yàn)討論50-52
• 第6章 結(jié)論52-54
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 綜述58-68
• 參考文獻(xiàn)65-68
• 作者攻讀學(xué)位期間的科研成果68-69
• 致謝69

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