本文關(guān)鍵詞：microRNA-24對內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達(dá)調(diào)節(jié)及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的為進(jìn)一步探討miRNA-24是否參與eNOS表達(dá)的調(diào)控及其對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響,本研究構(gòu)建miRNA-24高表達(dá)質(zhì)粒,并用脂質(zhì)體將其導(dǎo)入人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs),觀察miRNA-24對eNOS表達(dá)及HUVECs增殖的影響并探討其相關(guān)分子機(jī)制。方法1.miRNA-24對HUVECs增殖影響。用脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000將miRNA-24高表達(dá)質(zhì)粒、空白質(zhì)粒、anti-miRNA-24高表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入1640培養(yǎng)基孵育的HUVECs中,4h后更換含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在12h,24h,48 h,72 h四個時間點(diǎn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)細(xì)胞增殖數(shù)量；MTT檢測細(xì)胞增殖情況；細(xì)胞劃痕法檢測細(xì)胞遷移情況；Griess法檢測培養(yǎng)上清的NO含量。2.miRNA-24對eNOS表達(dá)的影響用脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000將miRNA-24高表達(dá)質(zhì)粒、空白質(zhì)粒、anti-miRNA-24高表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入1640培養(yǎng)基孵育的HUVECs中,4h后更換含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。實(shí)時熒光定量PCR檢測eNOS的mRNA表達(dá)情況；免疫組織化學(xué)法和Western blot法檢測eNOS蛋白質(zhì)表達(dá)水平。3.miRNA-24對SP-1表達(dá)的影響用脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000將miRNA-24高表達(dá)質(zhì)粒、空白質(zhì)粒、anti-miRNA-24高表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入1640培養(yǎng)基孵育的HUVECs中,4h后更換含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。熒光定量PCR檢測SP-1的mRNA表達(dá)情況；免疫組織化學(xué)法檢測SP-1蛋白質(zhì)表達(dá)情況；Western blot法檢測SP-1蛋白質(zhì)表達(dá)水平。4.證實(shí)eNOS和SP-1是miRNA-24的靶基因生物信息學(xué)結(jié)果顯示,miR-24通過與eNOS和Sp-1的3'-UTR結(jié)合參與其表達(dá)的調(diào)控,我們分別構(gòu)建了包含eNOS-3'UTR和SP-1-3'UTR區(qū)野生型、突變型序列的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(pMIR-Report)并分別命名為pGL3-eNOS-wt, pGL3-eNOS-mut, pGL3-Sp1-wt, pGL3-Sp1-mut,將HUVECs種于24孔板中,用脂質(zhì)體作為載體將報(bào)告質(zhì)粒和熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(海腎熒光素酶和miR-24或空白質(zhì)粒)一同轉(zhuǎn)染4小時。熒光酶素的活性由雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)檢測。結(jié)果1.與對照組比較,miRNA-24高表達(dá)組細(xì)胞數(shù)目減少(P0.01),增殖和遷移速度減慢(P0.05),NO釋放也明顯減少(P0.01)。2.與對照組比較,miRNA-24高表達(dá)組eNOS的mRNA和蛋白表達(dá)明顯減少(P0.05)。3.與對照組比較,miRNA-24高表達(dá)組SP-1的mRNA和蛋白表達(dá)明顯減少(P0.05)。4.與突變型報(bào)告質(zhì)粒相比較,野生型熒光酶素報(bào)告質(zhì)粒pGL3-eNOS-wt和pGL3-Sp-1-wt共轉(zhuǎn)染時miRNA-24可以顯著降低其活性(P0.01)結(jié)論1.高表達(dá)miRNA-24可以抑制人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,減少細(xì)胞數(shù)量,減少人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NO的合成。2.miRNA-24抑制]HUVECs中eNOS的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá),eNOS是HUVECs中miRNA-24的靶基因。3.miRNA-24抑制HUVECs中SP-1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá),SP-1是HUVECs中miRNA-24的靶基因。4.miRNA-24可存轉(zhuǎn)錄后水平通過影響細(xì)胞因子SP-1間接調(diào)控eNOS在HUVECs的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：miRNA-24 HUVECs 細(xì)胞增殖 eNOS NO SP-1
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 主要中英文縮略寫6-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-19
• 參考文獻(xiàn)16-19
• 第一部分 miR-24對HUVECs增殖的影響19-35
• 實(shí)驗(yàn)材料19-21
• 實(shí)驗(yàn)方法21-26
• 結(jié)果26-30
• 討論30-32
• 小結(jié)32-33
• 參考文獻(xiàn)33-35
• 第二部分 miR-24對內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達(dá)的影響及相關(guān)分子機(jī)制35-56
• 實(shí)驗(yàn)材料35-37
• 實(shí)驗(yàn)方法37-42
• 結(jié)果42-50
• 討論50-53
• 小結(jié)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-56
• 全文總結(jié)56-59
• 綜述59-72
• 參考文獻(xiàn)68-72
• 致謝72-73
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文73-75
• 攻讀碩士學(xué)位期間參加科研項(xiàng)目75

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 嚴(yán)麗梅;吳建勇;于瀟華;徐競鷗;歐和生;;內(nèi)含子源性microRNA對內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達(dá)及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2010年07期

  本文關(guān)鍵詞：microRNA-24對內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達(dá)調(diào)節(jié)及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：317798