本文關鍵詞：非病毒多基因納米傳遞與成纖維細胞的神經(jīng)分化研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：直接重編程是指將一種終末分化的細胞直接轉(zhuǎn)變成另一種終末分化的細胞,這一技術的產(chǎn)生為細胞移植在臨床中的應用提供了新的細胞來源。在成神經(jīng)細胞分化的研究中主要依靠病毒載體,而病毒載體本身具有潛在的安全隱患,使該技術的應用受到限制,納米粒具有安全、高效等優(yōu)點,已經(jīng)受到越來越多的關注。本文重點圍繞神經(jīng)細胞的直接重編程展開研究,通過制備乙二胺修飾的陽離子化紫菜多糖,并將其作為基因載體攜神經(jīng)相關轉(zhuǎn)錄因子,將小鼠成纖維細胞直接重編程為神經(jīng)細胞,主要分為四個部分:第一章綜述本章對基因治療中載體的發(fā)展進行了簡要綜述,比較了不同載體的優(yōu)缺點,對各載體的應用作了簡單介紹;并對可用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細胞來源,不同來源細胞的優(yōu)缺點以及細胞來源途徑的發(fā)展趨勢及面臨的問題進行了簡要敘述,為本學位論文設計思想的提出及后續(xù)實驗工作的開展奠定基礎。第二章陽離子化紫菜多糖的制備及表征本項目研究以紫菜多糖為對象,采用高碘酸鉀氧化法對紫菜多糖進行氧化,再利用乙二胺及精胺兩種陽離子化試劑分別對氧化后的紫菜多糖進行陽離子化,得到乙二胺陽離子化紫菜多糖(Ed-PYP)和精胺陽離子化紫菜多糖(Sm-PYP),采用傅里葉變換紅外光譜分析儀對兩種陽離子化的多糖進行結(jié)構檢測,采用Zeta電位粒徑儀對其進行表征,為進一步研究陽離子化紫菜多糖在基因載體中的應用打下基礎。第三章乙二胺陽離子化的紫菜多糖作為基因載體的初步探究以陽離子化多糖為載體,成纖維細胞為種子細胞,通過瓊脂糖凝膠電泳對Ed-PYP/pDNA復合物表征,采用MTT實驗對其進行毒性檢測,實驗結(jié)果初步表明其具有載基因能力。通過綠色熒光蛋白(EGFP)及ELISA分別從可視化角度及蛋白水平來評價Ed-PYP/pDNA復合物的體外轉(zhuǎn)染效率,結(jié)果表明在Ed-PYP/pDNA質(zhì)量比為40:1,其體外轉(zhuǎn)染效率為最佳且優(yōu)于PEI及Lip2000。通過質(zhì)粒DNA的熒光標記物YOYO-1以及多種特異性抑制劑考察Ed-PYP/pDNA納米粒(40:1)的穿膜機制及胞內(nèi)轉(zhuǎn)運機理。結(jié)果表明,Ed-PYP/pDNA復合物是通過網(wǎng)格蛋白以及小窩蛋白介導的Qg吞途徑進入胞內(nèi),而其在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程是由內(nèi)涵體-溶酶體系統(tǒng)、細胞骨架結(jié)構、中間纖維結(jié)構以及動力蛋白多系統(tǒng)參與的。第四章成纖維誘導分化為神經(jīng)的研究根據(jù)前文研究結(jié)果,將Ed-PYP與神經(jīng)相關轉(zhuǎn)錄因子的復合物按最佳比例(40:1)混合制成納米粒(Ed-PYP/pABF、Ed-PYP/pABT)用于轉(zhuǎn)染成纖維細胞,擬對其進行成神經(jīng)誘導分化,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、TEM、Zeta電位粒徑儀等手段對其進行表征,結(jié)果與預實驗吻合。通過細胞形態(tài)觀察及ELISA檢測表明誘導第14天時效果最佳。通過免疫熒光以及蛋白免疫印跡進一步鑒定誘導后的成纖維細胞,結(jié)果表明,陽離子化紫菜多糖攜神經(jīng)相關轉(zhuǎn)錄基因可將成纖維細胞直接重編程為神經(jīng)細胞。本研究為細胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)相關疾病提供了豐富的細胞來源。
【關鍵詞】：成纖維細胞 直接重編程 神經(jīng)細胞 非病毒載體 多基因
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R943
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 引言13-14
• 第一章 綜述14-26
• 1 載體的發(fā)展15-18
• 1.1 基因治療的概念及發(fā)展15
• 1.2 基因轉(zhuǎn)移途徑15
• 1.3 基因載體15-18
• 2 神經(jīng)損傷及細胞治療18-24
• 2.1 神經(jīng)系統(tǒng)損傷18-19
• 2.2 細胞療法19-24
• 2.2.1 胚胎干細胞19-20
• 2.2.2 神經(jīng)干細胞20
• 2.2.3 骨髓間充質(zhì)干細胞20-21
• 2.2.4 臍帶血干細胞21
• 2.2.5 脂肪干細胞21-22
• 2.2.6 雪旺細胞22
• 2.2.7 嗅鞘細胞22-23
• 2.2.8 誘導多能干細胞23
• 2.2.9 直接重編程細胞23-24
• 3 展望24
• 4 本課題的選題依據(jù)以及設計思路24-26
• 4.1 選題依據(jù)24-25
• 4.2 設計思路25-26
• 第二章 陽離子化紫菜多糖的制備及表征26-31
• 1 儀器與試劑26-27
• 1.1 儀器26
• 1.2 試劑26-27
• 2 方法27-28
• 2.1 陽離子化紫菜多糖的制備27
• 2.1.1 氧化多糖的制備27
• 2.1.2 陽離子化多糖的制備27
• 2.2 陽離子化多糖的表征27-28
• 2.2.1 紅外光譜的測定27-28
• 2.2.2 電位的測定28
• 3 實驗結(jié)果28-29
• 3.1 紅外光譜的測定28
• 3.2 電位的測定28-29
• 4 討論29-30
• 5 本章小結(jié)30-31
• 第三章 乙二胺陽離子化的紫菜多糖作為基因載體的初步探究31-51
• 1 儀器與試劑31-34
• 1.1 儀器31-32
• 1.2 試劑32-33
• 1.3 主要溶液33-34
• 2 方法34-41
• 2.1 質(zhì)粒DNA的制備34-36
• 2.1.1 DH5α 感受態(tài)的制備34-35
• 2.1.2 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌35
• 2.1.3 轉(zhuǎn)化克隆的篩選和鑒定35-36
• 2.2 Ed-PYP/pDNA復合物的制備及瓊脂糖凝膠電泳36-37
• 2.3 Ed-PYP作為基因載體的初步探究37-41
• 2.3.1 細胞培養(yǎng)37-38
• 2.3.2 Ed-PYP/pDNA細胞毒性的測定38
• 2.3.3 Ed-PYP細胞轉(zhuǎn)染效果考察38-39
• 2.3.4 Ed-PYP/pDNA復合物的體外轉(zhuǎn)染效果39
• 2.3.5 Ed-PYP/pDNA復合物的攝取及轉(zhuǎn)運機理研究39-41
• 3 實驗結(jié)果41-48
• 3.1 質(zhì)粒DNA（Ascl1及EGFP）的制備41-42
• 3.2 基因滯留實驗結(jié)果42
• 3.3 細胞毒性的結(jié)果42-43
• 3.4 熒光法測定Ed-PYP/pDNA復合物的轉(zhuǎn)染43-45
• 3.5 ELISA法測定Ed-PYP/pDNA復合物的轉(zhuǎn)染45
• 3.6 Ed-PYP/pDNA復合物的攝取及轉(zhuǎn)運機理研究45-48
• 3.6.1 Ed-PYP/pDNA復合物穿膜機制45-47
• 3.6.2 Ed-PYP/pDNA復合物胞內(nèi)轉(zhuǎn)運機制47-48
• 4 討論48-50
• 5 本章小結(jié)50-51
• 第四章 成纖維細胞的神經(jīng)分化51-73
• 1 儀器與試劑51-54
• 1.1 儀器51-52
• 1.2 試劑52-53
• 1.3 主要溶液53-54
• 2 方法54-58
• 2.1 質(zhì)粒DNA的制備54
• 2.2 Ed-PYP/pDNA復合物的制備54-55
• 2.3 Ed-PYP/pDNA復合物的表征55
• 2.3.1 瓊脂糖凝膠電泳55
• 2.3.2 電位及粒徑測定55
• 2.4 細胞培養(yǎng)55
• 2.5 成纖維細胞向神經(jīng)細胞直接重編程55-56
• 2.6 神經(jīng)細胞的鑒定56-58
• 2.6.1 細胞形態(tài)學觀察56
• 2.6.2 ELISA試劑盒鑒定神經(jīng)相關因子表達56
• 2.6.3 免疫熒光鑒定（雙染）56-57
• 2.6.4 蛋白免疫印跡（Western blotting, WB）57-58
• 3 實驗結(jié)果58-70
• 3.1 質(zhì)粒DNA的鑒定58
• 3.2 Ed-PYP/pDNA復合物的表征58-63
• 3.2.1 瓊脂糖凝膠電泳58-59
• 3.2.2 Ed-PYP/pDNA復合物的形態(tài)及Zeta電位59-63
• 3.3 誘導形態(tài)學變化63-64
• 3.4 ELISA檢測神經(jīng)相關蛋白表達64-66
• 3.5 免疫熒光鑒定66-67
• 3.6 蛋白免疫印跡（Western blotting, WB）67-70
• 4 討論70-72
• 5 本章小結(jié)72-73
• 全文總結(jié)73-75
• 本文創(chuàng)新點如下75-76
• 參考文獻76-87
• 致謝87-88
• 攻讀碩士期間發(fā)表的相關論文88

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本文編號：312861