發(fā)布時(shí)間：2017-04-17 09:04

  本文關(guān)鍵詞：非病毒多基因納米傳遞與成纖維細(xì)胞的神經(jīng)分化研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：直接重編程是指將一種終末分化的細(xì)胞直接轉(zhuǎn)變成另一種終末分化的細(xì)胞,這一技術(shù)的產(chǎn)生為細(xì)胞移植在臨床中的應(yīng)用提供了新的細(xì)胞來(lái)源。在成神經(jīng)細(xì)胞分化的研究中主要依靠病毒載體,而病毒載體本身具有潛在的安全隱患,使該技術(shù)的應(yīng)用受到限制,納米粒具有安全、高效等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)受到越來(lái)越多的關(guān)注。本文重點(diǎn)圍繞神經(jīng)細(xì)胞的直接重編程展開研究,通過(guò)制備乙二胺修飾的陽(yáng)離子化紫菜多糖,并將其作為基因載體攜神經(jīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,將小鼠成纖維細(xì)胞直接重編程為神經(jīng)細(xì)胞,主要分為四個(gè)部分:第一章綜述本章對(duì)基因治療中載體的發(fā)展進(jìn)行了簡(jiǎn)要綜述,比較了不同載體的優(yōu)缺點(diǎn),對(duì)各載體的應(yīng)用作了簡(jiǎn)單介紹;并對(duì)可用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞來(lái)源,不同來(lái)源細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn)以及細(xì)胞來(lái)源途徑的發(fā)展趨勢(shì)及面臨的問(wèn)題進(jìn)行了簡(jiǎn)要敘述,為本學(xué)位論文設(shè)計(jì)思想的提出及后續(xù)實(shí)驗(yàn)工作的開展奠定基礎(chǔ)。第二章陽(yáng)離子化紫菜多糖的制備及表征本項(xiàng)目研究以紫菜多糖為對(duì)象,采用高碘酸鉀氧化法對(duì)紫菜多糖進(jìn)行氧化,再利用乙二胺及精胺兩種陽(yáng)離子化試劑分別對(duì)氧化后的紫菜多糖進(jìn)行陽(yáng)離子化,得到乙二胺陽(yáng)離子化紫菜多糖(Ed-PYP)和精胺陽(yáng)離子化紫菜多糖(Sm-PYP),采用傅里葉變換紅外光譜分析儀對(duì)兩種陽(yáng)離子化的多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)檢測(cè),采用Zeta電位粒徑儀對(duì)其進(jìn)行表征,為進(jìn)一步研究陽(yáng)離子化紫菜多糖在基因載體中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。第三章乙二胺陽(yáng)離子化的紫菜多糖作為基因載體的初步探究以陽(yáng)離子化多糖為載體,成纖維細(xì)胞為種子細(xì)胞,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)Ed-PYP/pDNA復(fù)合物表征,采用MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行毒性檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明其具有載基因能力。通過(guò)綠色熒光蛋白(EGFP)及ELISA分別從可視化角度及蛋白水平來(lái)評(píng)價(jià)Ed-PYP/pDNA復(fù)合物的體外轉(zhuǎn)染效率,結(jié)果表明在Ed-PYP/pDNA質(zhì)量比為40:1,其體外轉(zhuǎn)染效率為最佳且優(yōu)于PEI及Lip2000。通過(guò)質(zhì)粒DNA的熒光標(biāo)記物YOYO-1以及多種特異性抑制劑考察Ed-PYP/pDNA納米粒(40:1)的穿膜機(jī)制及胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理。結(jié)果表明,Ed-PYP/pDNA復(fù)合物是通過(guò)網(wǎng)格蛋白以及小窩蛋白介導(dǎo)的Qg吞途徑進(jìn)入胞內(nèi),而其在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程是由內(nèi)涵體-溶酶體系統(tǒng)、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、中間纖維結(jié)構(gòu)以及動(dòng)力蛋白多系統(tǒng)參與的。第四章成纖維誘導(dǎo)分化為神經(jīng)的研究根據(jù)前文研究結(jié)果,將Ed-PYP與神經(jīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的復(fù)合物按最佳比例(40:1)混合制成納米粒(Ed-PYP/pABF、Ed-PYP/pABT)用于轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞,擬對(duì)其進(jìn)行成神經(jīng)誘導(dǎo)分化,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、TEM、Zeta電位粒徑儀等手段對(duì)其進(jìn)行表征,結(jié)果與預(yù)實(shí)驗(yàn)吻合。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察及ELISA檢測(cè)表明誘導(dǎo)第14天時(shí)效果最佳。通過(guò)免疫熒光以及蛋白免疫印跡進(jìn)一步鑒定誘導(dǎo)后的成纖維細(xì)胞,結(jié)果表明,陽(yáng)離子化紫菜多糖攜神經(jīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄基因可將成纖維細(xì)胞直接重編程為神經(jīng)細(xì)胞。本研究為細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病提供了豐富的細(xì)胞來(lái)源。
【關(guān)鍵詞】：成纖維細(xì)胞 直接重編程 神經(jīng)細(xì)胞 非病毒載體 多基因
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R943
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 引言13-14
• 第一章 綜述14-26
• 1 載體的發(fā)展15-18
• 1.1 基因治療的概念及發(fā)展15
• 1.2 基因轉(zhuǎn)移途徑15
• 1.3 基因載體15-18
• 2 神經(jīng)損傷及細(xì)胞治療18-24
• 2.1 神經(jīng)系統(tǒng)損傷18-19
• 2.2 細(xì)胞療法19-24
• 2.2.1 胚胎干細(xì)胞19-20
• 2.2.2 神經(jīng)干細(xì)胞20
• 2.2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞20-21
• 2.2.4 臍帶血干細(xì)胞21
• 2.2.5 脂肪干細(xì)胞21-22
• 2.2.6 雪旺細(xì)胞22
• 2.2.7 嗅鞘細(xì)胞22-23
• 2.2.8 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞23
• 2.2.9 直接重編程細(xì)胞23-24
• 3 展望24
• 4 本課題的選題依據(jù)以及設(shè)計(jì)思路24-26
• 4.1 選題依據(jù)24-25
• 4.2 設(shè)計(jì)思路25-26
• 第二章 陽(yáng)離子化紫菜多糖的制備及表征26-31
• 1 儀器與試劑26-27
• 1.1 儀器26
• 1.2 試劑26-27
• 2 方法27-28
• 2.1 陽(yáng)離子化紫菜多糖的制備27
• 2.1.1 氧化多糖的制備27
• 2.1.2 陽(yáng)離子化多糖的制備27
• 2.2 陽(yáng)離子化多糖的表征27-28
• 2.2.1 紅外光譜的測(cè)定27-28
• 2.2.2 電位的測(cè)定28
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-29
• 3.1 紅外光譜的測(cè)定28
• 3.2 電位的測(cè)定28-29
• 4 討論29-30
• 5 本章小結(jié)30-31
• 第三章 乙二胺陽(yáng)離子化的紫菜多糖作為基因載體的初步探究31-51
• 1 儀器與試劑31-34
• 1.1 儀器31-32
• 1.2 試劑32-33
• 1.3 主要溶液33-34
• 2 方法34-41
• 2.1 質(zhì)粒DNA的制備34-36
• 2.1.1 DH5α 感受態(tài)的制備34-35
• 2.1.2 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌35
• 2.1.3 轉(zhuǎn)化克隆的篩選和鑒定35-36
• 2.2 Ed-PYP/pDNA復(fù)合物的制備及瓊脂糖凝膠電泳36-37
• 2.3 Ed-PYP作為基因載體的初步探究37-41
• 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)37-38
• 2.3.2 Ed-PYP/pDNA細(xì)胞毒性的測(cè)定38
• 2.3.3 Ed-PYP細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果考察38-39
• 2.3.4 Ed-PYP/pDNA復(fù)合物的體外轉(zhuǎn)染效果39
• 2.3.5 Ed-PYP/pDNA復(fù)合物的攝取及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理研究39-41
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-48
• 3.1 質(zhì)粒DNA（Ascl1及EGFP）的制備41-42
• 3.2 基因滯留實(shí)驗(yàn)結(jié)果42
• 3.3 細(xì)胞毒性的結(jié)果42-43
• 3.4 熒光法測(cè)定Ed-PYP/pDNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染43-45
• 3.5 ELISA法測(cè)定Ed-PYP/pDNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染45
• 3.6 Ed-PYP/pDNA復(fù)合物的攝取及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理研究45-48
• 3.6.1 Ed-PYP/pDNA復(fù)合物穿膜機(jī)制45-47
• 3.6.2 Ed-PYP/pDNA復(fù)合物胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制47-48
• 4 討論48-50
• 5 本章小結(jié)50-51
• 第四章 成纖維細(xì)胞的神經(jīng)分化51-73
• 1 儀器與試劑51-54
• 1.1 儀器51-52
• 1.2 試劑52-53
• 1.3 主要溶液53-54
• 2 方法54-58
• 2.1 質(zhì)粒DNA的制備54
• 2.2 Ed-PYP/pDNA復(fù)合物的制備54-55
• 2.3 Ed-PYP/pDNA復(fù)合物的表征55
• 2.3.1 瓊脂糖凝膠電泳55
• 2.3.2 電位及粒徑測(cè)定55
• 2.4 細(xì)胞培養(yǎng)55
• 2.5 成纖維細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞直接重編程55-56
• 2.6 神經(jīng)細(xì)胞的鑒定56-58
• 2.6.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察56
• 2.6.2 ELISA試劑盒鑒定神經(jīng)相關(guān)因子表達(dá)56
• 2.6.3 免疫熒光鑒定（雙染）56-57
• 2.6.4 蛋白免疫印跡（Western blotting, WB）57-58
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果58-70
• 3.1 質(zhì)粒DNA的鑒定58
• 3.2 Ed-PYP/pDNA復(fù)合物的表征58-63
• 3.2.1 瓊脂糖凝膠電泳58-59
• 3.2.2 Ed-PYP/pDNA復(fù)合物的形態(tài)及Zeta電位59-63
• 3.3 誘導(dǎo)形態(tài)學(xué)變化63-64
• 3.4 ELISA檢測(cè)神經(jīng)相關(guān)蛋白表達(dá)64-66
• 3.5 免疫熒光鑒定66-67
• 3.6 蛋白免疫印跡（Western blotting, WB）67-70
• 4 討論70-72
• 5 本章小結(jié)72-73
• 全文總結(jié)73-75
• 本文創(chuàng)新點(diǎn)如下75-76
• 參考文獻(xiàn)76-87
• 致謝87-88
• 攻讀碩士期間發(fā)表的相關(guān)論文88

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本文編號(hào)：312861