發(fā)布時間：2017-04-07 19:09

  本文關鍵詞：腺苷受體介導的cAMP信號通路在對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肝臟是人體消化系統(tǒng)中最大的消化腺,亦是最主要的藥物代謝器官,對來自體內和體外的很多非營養(yǎng)物質如藥物、毒物以及體內某些代謝產物,具有生物轉化作用。在藥物使用過程中,因藥物或其代謝產物引起的肝組織的生理功能變化或免疫應答所引起的肝損傷稱為藥物性肝損傷(drug-induced liver injury,DILI)。對乙酰氨基酚(別名撲熱息痛,Acetaminophen,APAP),是目前應用最廣泛的解熱鎮(zhèn)痛藥,但該藥過量使用可引起肝細胞毒性,導致肝臟損傷。對乙酰氨基酚已在臨床廣泛使用,但如何合理抑制其肝毒性尚無良策。作為內源性嘌呤核苷的腺苷(adenosine)和腺苷受體(adenosine receptors,ARs)在很多疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。其中,腺苷受體廣泛存在于肝細胞,在肝臟疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用,但其在對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷機制中的作用尚未見報道。Chan等研究表明,當甲氨蝶呤等藥物刺激肝細胞時,腺苷釋放量會增加,腺苷受體通過介導c AMP-PKA信號通路參與肝臟炎癥的發(fā)生。Alchera等研究表明,腺苷增加導致肝細胞缺氧,炎癥,急性損傷,而過量的對乙酰氨基酚也造成肝細胞損傷。由此推測,在對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷過程中,對乙酰氨基酚通過激活ARs而引起肝細胞損傷,c AMP-PKA信號通路也參與其中。該實驗擬通過以對乙酰氨基酚灌胃制作藥物性肝損傷模型,探討ARs及其介導的c AMP-PKA信號通路在對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷中的作用。主要內容概括如下:1.對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型的建立將50只雄性昆明種小鼠隨機分為空白對照組和模型組。模型組給予對乙酰氨基酚500 mg/kg,空白對照組給予等量的生理鹽水,兩組均為單次灌胃給藥。24 h后分別于空白對照組和模型組中各取10只小鼠,檢測血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽汁酸(TBA)水平,HE染色觀察肝臟病理變化;剩余小鼠用于肝細胞提取。2.腺苷受體調節(jié)劑對對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷整體模型的影響將160只雄性昆明種小鼠隨機分為空白對照組、模型組、CPA組、DPCPX組、CPA+DPCPX組、CGS組、ZM241385組、CGS組+ZM241385組,參考文獻方法,分別給予0.9㳠的氯化鈉注射液500 mg/kg、對乙酰氨基酚500 mg/kg(生理鹽水配制),各組均為單次灌胃給藥。然后分別給予CPA組、DPCPX組、CPA+DPCPX組、CGS組、ZM241385組、CGS組+ZM241385組:CPA(0.05mg/kg,ip),DPCPX(0.1 mg/kg),CPA+DPCPX,CGS21680(0.2 mg/kg,i.p.),ZM241385(0.1 mg/kg),CGS21680+ZM241385。24 h后分別于每組中各取10只小鼠,眼眶取血并剖腹取肝,留取標本觀察肝臟生化指標和組織病理學改變;剩余小鼠用于肝細胞提取。3.肝細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定將雄性昆明種小鼠(40-60g)用10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉,酒精消毒其腹部皮膚。打開小鼠腹腔,將內臟撥到右邊,使門靜脈暴露并用靜脈注射器插入門靜脈。用在37 oC水浴中預熱過的EGTA溶液、0.075%I型膠原酶液依次灌注肝臟。待肝臟變?yōu)橥咙S色后進行分離并切割,加D-hanks使成肝組織液與0.075%I型膠原酶液。在室溫下將混合液搖動15min后過濾并離心,分離肝細胞。將肝細胞置于加有DMEM(含25%胎牛血清)的培養(yǎng)皿中培養(yǎng),48h更換培養(yǎng)液。結果顯示,肝細胞得率為1×109個/肝,肝細胞存活率為95%。4.腺苷受體在對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型中的表達由前期研究可知,對乙酰氨基酚在500 mg/kg,作用24 h時,藥物性肝損傷最為明顯。因此我們選之作為對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型的造模條件,并同時設空白對照組,選用實時定量PCR法及Western blot法檢測肝細胞中腺苷A1R、A2AR、A2BR、A3R表達水平。結果顯示,在正常肝細胞中腺苷A1R、A2AR、A2BR、A3R均有表達;在500 mg/kg對乙酰氨基酚作用24 h后,對乙酰氨基酚模型組與正常組比較,腺苷A1R和A2AR的表達水平明顯增高,A3R、A2BR表達未見明顯變化。結果表明,對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型及正常小鼠分離的肝細胞均表達腺苷A1R、A2AR、A2BR、A3R,且A1R、A2AR在對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型組表達明顯增高。5.對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型中腺苷A1R介導的c AMP信號通路的作用以1×105個/ml密度將肝細胞均勻接種于6孔板中,于24h后隨機分組進行實驗。實驗設空白對照組,模型組,PTX(Gi/o蛋白耦聯(lián)受體抑制劑)組,NECA(非選擇性ARs激動劑)組,NECA與PTX聯(lián)合用藥組。除正常對照組外其余各組肝細胞均取自以500mg/kg對乙酰氨基酚作用24h的小鼠。分別給予PTX組及NECA與PTX聯(lián)合用藥組肝細胞100ng/ml PTX進行刺激,24h后再給予NECA組及NECA與PTX聯(lián)合用藥組肝細胞以10μM NECA進行刺激,采用ELISA法于10min后檢測肝細胞內c AMP含量,Western blot法對PKA及磷酸化CREB在蛋白水平上的表達進行檢測。結果表明,模型組c AMP含量較正常組明顯升高;PKA、磷酸化CREB蛋白的表達較正常組明顯升高,在PTX,NECA刺激肝細胞后,模型組c AMP,PKA和磷酸化CREB蛋白的表達均進一步升高,且PTX刺激肝細胞后能顯著增強NECA的作用。結果提示,AR-Gi/o-AC-c AMP信號通路存在于肝細胞中,Gi/o蛋白耦聯(lián)受體抑制劑PTX通過抑制Gi/o-AC-c AMP通道,使非選擇性ARs激動劑NECA通過A2AR-Gs-AC-c AMP通道促進c AMP生成作用進一步加強。為進一步研究對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型中腺苷A1R及其介導的c AMP信號通路的作用,將肝細胞模型分別與1μM腺苷A1R激動劑CPA、10 n M腺苷A1R拮抗劑DPCPX、CPA與DPCPX聯(lián)合用藥組共同孵育48h。結果表明,經腺苷A1R激動劑CPA處理后,模型組肝細胞中c AMP含量及PKA、磷酸化CREB蛋白表達明顯下降。而在腺苷A1R拮抗劑DPCPX作用下,模型組c AMP含量及PKA、磷酸化CREB蛋白表達水平進一步升高。同時,CPA與DPCPX合用后可使二者單獨使用時產生的作用發(fā)生明顯逆轉。結果表明在對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷中A1R-Gi/o-AC-c AMP-PKA-CREB信號通路具有一定的作用。6.對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型中腺苷A2AR介導的c AMP信號通路的作用以1×105個/ml密度將肝細胞接種于6孔板中,于24h后隨機分組進行實驗。實驗設空白對照組,模型組,Rolipram(磷酸二酯酶(IV)抑制劑)組,NECA(非選擇性ARs激動劑)組,NECA與PTX聯(lián)合用藥組。除正常對照組外其余各組肝細胞均取自以500mg/kg對乙酰氨基酚作用24h的小鼠。以10μM Rolipram刺激Rolipram組及NECA與Rolipram聯(lián)合用藥組肝細胞,15min后再以10μM NECA刺激NECA組及NECA與Rolipram聯(lián)合用藥組肝細胞,10min后ELISA法檢測肝細胞內c AMP含量,Western blot法對PKA及磷酸化CREB在蛋白水平上的表達進行檢測。結果表明,模型組c AMP含量較正常組明顯升高;PKA、磷酸化CREB蛋白的表達較正常組明顯升高,模型組c AMP含量以及PKA和磷酸化CREB蛋白的表達在Rolipram和NECA作用下均能進一步升高。普遍認為主要有兩條途徑可升高細胞內c AMP含量:一是抑制細胞內磷酸二酯酶活性,二是激動腺苷受體;研究表明,磷酸二酯酶(IV)抑制劑Rolipram和非選擇性AR激動劑NECA均能夠使c AMP含量顯著增加。為研究對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型中腺苷A2AR及其介導的c AMP信號通路的作用,將肝細胞模型分別與1μM腺苷A2AR激動劑CGS21680、1μM腺苷A2AR拮抗劑ZM241385、CGS21680與ZM241385聯(lián)合用藥組共同孵育48h。結果表明,肝細胞經腺苷A2AR拮抗劑ZM241385處理后,模型組中c AMP含量及PKA、磷酸化CREB蛋白表達明顯下降。而在腺苷A2AR激動劑CGS21680作用下,模型組c AMP含量及PKA、磷酸化CREB蛋白表達水平進一步升高。同時,ZM241385與CGS21680聯(lián)合用藥組可使二者單獨使用時產生的作用發(fā)生明顯逆轉。結果證實在對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷中A2AR-Gs-AC-c AMP-PKA-CREB信號通路具有一定的作用。綜上所述,在對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型中,腺苷A1R和A2AR表達水平均較正常肝細胞明顯增強,腺苷A1R和A2AR共同參與調控對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷過程,腺苷A1R和A2AR拮抗劑在對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷中均具有顯著的抑制作用,但兩者對c AMP-PKA-CREB信號通路具有相反的調節(jié)作用。
【關鍵詞】：對乙酰氨基酚 腺苷受體 藥物性肝損傷 環(huán)磷酸腺苷 蛋白激酶A 環(huán)磷腺苷酸反應元件結合蛋白
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 英文縮略詞5-7
• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-18
• 前言18-19
• 1 實驗材料19-23
• 2 實驗方法23-32
• 3 實驗結果32-50
• 4 討論50-53
• 5 結論53-54
• 參考文獻54-59
• 附錄 個人簡歷59-60
• 致謝60-62
• 綜述62-72
• 參考文獻68-72

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 周艷杰;;異煙肼對大鼠肝組織bax、bcl-2表達的影響[J];毒理學雜志;2006年03期

2 李欽民;韓真;;茶多酚對雷公藤內酯醇致小鼠肝損害的保護作用[J];世界華人消化雜志;2006年09期

3 祿保平;楊曉娜;許家艷;;異煙肼灌胃建立小鼠急性肝損傷模型的研究[J];中國醫(yī)藥生物技術;2007年04期

4 王伽伯;肖小河;杜曉曦;鄒正升;宋海波;郭曉昕;;基于轉化毒理學的中藥肝損害客觀辨識與早期診斷[J];中國中藥雜志;2014年01期

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本文編號：291119