本文關(guān)鍵詞：腺苷受體介導(dǎo)的cAMP信號(hào)通路在對(duì)乙酰氨基酚致藥物性肝損傷中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肝臟是人體消化系統(tǒng)中最大的消化腺,亦是最主要的藥物代謝器官,對(duì)來自體內(nèi)和體外的很多非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如藥物、毒物以及體內(nèi)某些代謝產(chǎn)物,具有生物轉(zhuǎn)化作用。在藥物使用過程中,因藥物或其代謝產(chǎn)物引起的肝組織的生理功能變化或免疫應(yīng)答所引起的肝損傷稱為藥物性肝損傷(drug-induced liver injury,DILI)。對(duì)乙酰氨基酚(別名撲熱息痛,Acetaminophen,APAP),是目前應(yīng)用最廣泛的解熱鎮(zhèn)痛藥,但該藥過量使用可引起肝細(xì)胞毒性,導(dǎo)致肝臟損傷。對(duì)乙酰氨基酚已在臨床廣泛使用,但如何合理抑制其肝毒性尚無良策。作為內(nèi)源性嘌呤核苷的腺苷(adenosine)和腺苷受體(adenosine receptors,ARs)在很多疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。其中,腺苷受體廣泛存在于肝細(xì)胞,在肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用,但其在對(duì)乙酰氨基酚致藥物性肝損傷機(jī)制中的作用尚未見報(bào)道。Chan等研究表明,當(dāng)甲氨蝶呤等藥物刺激肝細(xì)胞時(shí),腺苷釋放量會(huì)增加,腺苷受體通過介導(dǎo)c AMP-PKA信號(hào)通路參與肝臟炎癥的發(fā)生。Alchera等研究表明,腺苷增加導(dǎo)致肝細(xì)胞缺氧,炎癥,急性損傷,而過量的對(duì)乙酰氨基酚也造成肝細(xì)胞損傷。由此推測(cè),在對(duì)乙酰氨基酚致藥物性肝損傷過程中,對(duì)乙酰氨基酚通過激活A(yù)Rs而引起肝細(xì)胞損傷,c AMP-PKA信號(hào)通路也參與其中。該實(shí)驗(yàn)擬通過以對(duì)乙酰氨基酚灌胃制作藥物性肝損傷模型,探討ARs及其介導(dǎo)的c AMP-PKA信號(hào)通路在對(duì)乙酰氨基酚致藥物性肝損傷中的作用。主要內(nèi)容概括如下:1.對(duì)乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型的建立將50只雄性昆明種小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和模型組。模型組給予對(duì)乙酰氨基酚500 mg/kg,空白對(duì)照組給予等量的生理鹽水,兩組均為單次灌胃給藥。24 h后分別于空白對(duì)照組和模型組中各取10只小鼠,檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽汁酸(TBA)水平,HE染色觀察肝臟病理變化;剩余小鼠用于肝細(xì)胞提取。2.腺苷受體調(diào)節(jié)劑對(duì)對(duì)乙酰氨基酚致藥物性肝損傷整體模型的影響將160只雄性昆明種小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、CPA組、DPCPX組、CPA+DPCPX組、CGS組、ZM241385組、CGS組+ZM241385組,參考文獻(xiàn)方法,分別給予0.9㳠的氯化鈉注射液500 mg/kg、對(duì)乙酰氨基酚500 mg/kg(生理鹽水配制),各組均為單次灌胃給藥。然后分別給予CPA組、DPCPX組、CPA+DPCPX組、CGS組、ZM241385組、CGS組+ZM241385組:CPA(0.05mg/kg,ip),DPCPX(0.1 mg/kg),CPA+DPCPX,CGS21680(0.2 mg/kg,i.p.),ZM241385(0.1 mg/kg),CGS21680+ZM241385。24 h后分別于每組中各取10只小鼠,眼眶取血并剖腹取肝,留取標(biāo)本觀察肝臟生化指標(biāo)和組織病理學(xué)改變;剩余小鼠用于肝細(xì)胞提取。3.肝細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定將雄性昆明種小鼠(40-60g)用10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉,酒精消毒其腹部皮膚。打開小鼠腹腔,將內(nèi)臟撥到右邊,使門靜脈暴露并用靜脈注射器插入門靜脈。用在37 oC水浴中預(yù)熱過的EGTA溶液、0.075%I型膠原酶液依次灌注肝臟。待肝臟變?yōu)橥咙S色后進(jìn)行分離并切割,加D-hanks使成肝組織液與0.075%I型膠原酶液。在室溫下將混合液搖動(dòng)15min后過濾并離心,分離肝細(xì)胞。將肝細(xì)胞置于加有DMEM(含25%胎牛血清)的培養(yǎng)皿中培養(yǎng),48h更換培養(yǎng)液。結(jié)果顯示,肝細(xì)胞得率為1×109個(gè)/肝,肝細(xì)胞存活率為95%。4.腺苷受體在對(duì)乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型中的表達(dá)由前期研究可知,對(duì)乙酰氨基酚在500 mg/kg,作用24 h時(shí),藥物性肝損傷最為明顯。因此我們選之作為對(duì)乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型的造模條件,并同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組,選用實(shí)時(shí)定量PCR法及Western blot法檢測(cè)肝細(xì)胞中腺苷A1R、A2AR、A2BR、A3R表達(dá)水平。結(jié)果顯示,在正常肝細(xì)胞中腺苷A1R、A2AR、A2BR、A3R均有表達(dá);在500 mg/kg對(duì)乙酰氨基酚作用24 h后,對(duì)乙酰氨基酚模型組與正常組比較,腺苷A1R和A2AR的表達(dá)水平明顯增高,A3R、A2BR表達(dá)未見明顯變化。結(jié)果表明,對(duì)乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型及正常小鼠分離的肝細(xì)胞均表達(dá)腺苷A1R、A2AR、A2BR、A3R,且A1R、A2AR在對(duì)乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型組表達(dá)明顯增高。5.對(duì)乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型中腺苷A1R介導(dǎo)的c AMP信號(hào)通路的作用以1×105個(gè)/ml密度將肝細(xì)胞均勻接種于6孔板中,于24h后隨機(jī)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組,模型組,PTX(Gi/o蛋白耦聯(lián)受體抑制劑)組,NECA(非選擇性ARs激動(dòng)劑)組,NECA與PTX聯(lián)合用藥組。除正常對(duì)照組外其余各組肝細(xì)胞均取自以500mg/kg對(duì)乙酰氨基酚作用24h的小鼠。分別給予PTX組及NECA與PTX聯(lián)合用藥組肝細(xì)胞100ng/ml PTX進(jìn)行刺激,24h后再給予NECA組及NECA與PTX聯(lián)合用藥組肝細(xì)胞以10μM NECA進(jìn)行刺激,采用ELISA法于10min后檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)c AMP含量,Western blot法對(duì)PKA及磷酸化CREB在蛋白水平上的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,模型組c AMP含量較正常組明顯升高;PKA、磷酸化CREB蛋白的表達(dá)較正常組明顯升高,在PTX,NECA刺激肝細(xì)胞后,模型組c AMP,PKA和磷酸化CREB蛋白的表達(dá)均進(jìn)一步升高,且PTX刺激肝細(xì)胞后能顯著增強(qiáng)NECA的作用。結(jié)果提示,AR-Gi/o-AC-c AMP信號(hào)通路存在于肝細(xì)胞中,Gi/o蛋白耦聯(lián)受體抑制劑PTX通過抑制Gi/o-AC-c AMP通道,使非選擇性ARs激動(dòng)劑NECA通過A2AR-Gs-AC-c AMP通道促進(jìn)c AMP生成作用進(jìn)一步加強(qiáng)。為進(jìn)一步研究對(duì)乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型中腺苷A1R及其介導(dǎo)的c AMP信號(hào)通路的作用,將肝細(xì)胞模型分別與1μM腺苷A1R激動(dòng)劑CPA、10 n M腺苷A1R拮抗劑DPCPX、CPA與DPCPX聯(lián)合用藥組共同孵育48h。結(jié)果表明,經(jīng)腺苷A1R激動(dòng)劑CPA處理后,模型組肝細(xì)胞中c AMP含量及PKA、磷酸化CREB蛋白表達(dá)明顯下降。而在腺苷A1R拮抗劑DPCPX作用下,模型組c AMP含量及PKA、磷酸化CREB蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高。同時(shí),CPA與DPCPX合用后可使二者單獨(dú)使用時(shí)產(chǎn)生的作用發(fā)生明顯逆轉(zhuǎn)。結(jié)果表明在對(duì)乙酰氨基酚致藥物性肝損傷中A1R-Gi/o-AC-c AMP-PKA-CREB信號(hào)通路具有一定的作用。6.對(duì)乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型中腺苷A2AR介導(dǎo)的c AMP信號(hào)通路的作用以1×105個(gè)/ml密度將肝細(xì)胞接種于6孔板中,于24h后隨機(jī)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組,模型組,Rolipram(磷酸二酯酶(IV)抑制劑)組,NECA(非選擇性ARs激動(dòng)劑)組,NECA與PTX聯(lián)合用藥組。除正常對(duì)照組外其余各組肝細(xì)胞均取自以500mg/kg對(duì)乙酰氨基酚作用24h的小鼠。以10μM Rolipram刺激Rolipram組及NECA與Rolipram聯(lián)合用藥組肝細(xì)胞,15min后再以10μM NECA刺激NECA組及NECA與Rolipram聯(lián)合用藥組肝細(xì)胞,10min后ELISA法檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)c AMP含量,Western blot法對(duì)PKA及磷酸化CREB在蛋白水平上的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,模型組c AMP含量較正常組明顯升高;PKA、磷酸化CREB蛋白的表達(dá)較正常組明顯升高,模型組c AMP含量以及PKA和磷酸化CREB蛋白的表達(dá)在Rolipram和NECA作用下均能進(jìn)一步升高。普遍認(rèn)為主要有兩條途徑可升高細(xì)胞內(nèi)c AMP含量:一是抑制細(xì)胞內(nèi)磷酸二酯酶活性,二是激動(dòng)腺苷受體;研究表明,磷酸二酯酶(IV)抑制劑Rolipram和非選擇性AR激動(dòng)劑NECA均能夠使c AMP含量顯著增加。為研究對(duì)乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型中腺苷A2AR及其介導(dǎo)的c AMP信號(hào)通路的作用,將肝細(xì)胞模型分別與1μM腺苷A2AR激動(dòng)劑CGS21680、1μM腺苷A2AR拮抗劑ZM241385、CGS21680與ZM241385聯(lián)合用藥組共同孵育48h。結(jié)果表明,肝細(xì)胞經(jīng)腺苷A2AR拮抗劑ZM241385處理后,模型組中c AMP含量及PKA、磷酸化CREB蛋白表達(dá)明顯下降。而在腺苷A2AR激動(dòng)劑CGS21680作用下,模型組c AMP含量及PKA、磷酸化CREB蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高。同時(shí),ZM241385與CGS21680聯(lián)合用藥組可使二者單獨(dú)使用時(shí)產(chǎn)生的作用發(fā)生明顯逆轉(zhuǎn)。結(jié)果證實(shí)在對(duì)乙酰氨基酚致藥物性肝損傷中A2AR-Gs-AC-c AMP-PKA-CREB信號(hào)通路具有一定的作用。綜上所述,在對(duì)乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型中,腺苷A1R和A2AR表達(dá)水平均較正常肝細(xì)胞明顯增強(qiáng),腺苷A1R和A2AR共同參與調(diào)控對(duì)乙酰氨基酚致藥物性肝損傷過程,腺苷A1R和A2AR拮抗劑在對(duì)乙酰氨基酚致藥物性肝損傷中均具有顯著的抑制作用,但兩者對(duì)c AMP-PKA-CREB信號(hào)通路具有相反的調(diào)節(jié)作用。
【關(guān)鍵詞】：對(duì)乙酰氨基酚 腺苷受體 藥物性肝損傷 環(huán)磷酸腺苷 蛋白激酶A 環(huán)磷腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 英文縮略詞5-7
• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-18
• 前言18-19
• 1 實(shí)驗(yàn)材料19-23
• 2 實(shí)驗(yàn)方法23-32
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-50
• 4 討論50-53
• 5 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 附錄 個(gè)人簡(jiǎn)歷59-60
• 致謝60-62
• 綜述62-72
• 參考文獻(xiàn)68-72

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

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  本文關(guān)鍵詞：腺苷受體介導(dǎo)的cAMP信號(hào)通路在對(duì)乙酰氨基酚致藥物性肝損傷中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：291119