發(fā)布時間：2017-04-05 20:17

  本文關(guān)鍵詞：紫杉肽中紫杉醇含量分析研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的紫杉醇是從紅豆杉中提取的抗腫瘤藥物,水溶性較差。紫杉肽是紫杉醇的聚合衍生物,是在紫杉醇C13側(cè)鏈的2’位上通過酯鍵與多肽聚合而成,分子量在10～40kDa范圍內(nèi)。紫杉肽表現(xiàn)出良好的水溶性和抗腫瘤活性。紫杉肽中紫杉醇含量分析方法的建立對紫杉肽研發(fā)具有重要意義,雖然可以通過紫杉肽制備過程中的投料量確定紫杉醇理論含量,但是,紫杉肽的分子量不均一且結(jié)構(gòu)復(fù)雜,難以對其中紫杉醇的含量進行準確測定,未見國內(nèi)文獻報道利用色譜法測定紫杉肽中紫杉醇含量。本研究旨在建立紫杉肽中紫杉醇含量的體內(nèi)、外分析方法,為紫杉肽的藥學(xué)資料研究、毒理學(xué)、藥理學(xué)研究和臨床研究中的含量分析提供參考依據(jù)。研究方法在紫杉肽中包括與多肽鏈結(jié)合的結(jié)合型紫杉醇和未與多肽鏈結(jié)合的游離型紫杉醇。首先,建立游離紫杉醇的含量分析方法,紫杉肽經(jīng)液-液萃取法萃取其中游離紫杉醇后,通過HPLC法檢測分析；分別通過不同種類蛋白酶和不同pH溶液水解連接紫杉醇和多肽鏈的酯鍵,以液-液萃取法萃取其中紫杉醇后,HPLC法檢測分析,通過與紫杉肽中紫杉醇理論含量比較,初步確定水解反應(yīng)的效率；通過對紫杉肽在不同溶液中水解規(guī)律的研究,發(fā)現(xiàn)紫杉肽及紫杉醇在pH13.0溶液中極不穩(wěn)定,將反應(yīng)后溶液分離、純化后,得到紫杉醇的單一水解產(chǎn)物,通過對紫杉醇穩(wěn)定且特有的水解產(chǎn)物的鑒定和檢測分析,間接對紫杉肽中紫杉醇含量進行測定。研究結(jié)果1.紫杉肽中游離紫杉醇含量測定及方法學(xué)確證。紫杉肽中游離紫杉醇以乙醚萃取后,參考《中華人民共和國藥典》二部(2010版)紫杉醇注射制劑含量分析方法,建立了紫杉醇HPLC分析方法,采用Thermo Hypersil GOLD (4.6×150 mm,5μm)色譜柱,流動相為乙腈：水(50：50,v/v),檢測波長為227 nm。實驗結(jié)果表明,該方法專屬性、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好,簡單、易操作,適用于紫杉醇的含量分析研究。測得5個批次紫杉肽中,每瓶含游離紫杉醇的量在21.6～79.2μg范圍內(nèi)。2.紫杉肽中結(jié)合型紫杉醇解離實驗。紫杉肽分別經(jīng)枯草桿菌蛋白酶、嗜熱桿菌蛋白酶和pH 1.9～13.0溶液水解處理后,以乙醚萃取其中紫杉醇并檢測分析,通過與紫杉肽中紫杉醇理論含量比較,計算水解比率。結(jié)果表明,不同溶液中紫杉肽的水解比率各不相同：紫杉肽經(jīng)嗜熱桿菌蛋白酶處理后,測得酶解率為10.57%,紫杉肽經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后,測得酶解率為12.49%；紫杉肽經(jīng)pH 9.2溶液處理后,測得紫杉醇量最高,約占紫杉醇理論含量的23.29%。兩種方法測得結(jié)果均與紫杉肽中紫杉醇理論含量相差較多,可能原因有紫杉醇在處理條件下不穩(wěn)定和處理過程不徹底。因此,以上兩種方法未能將紫杉肽中的紫杉醇穩(wěn)定可控的解離,從而實現(xiàn)紫杉肽中紫杉醇含量分析的目的。當以pH為13.0溶液溶解紫杉肽后,未檢測到紫杉醇,說明紫杉醇在該條件下極不穩(wěn)定。3.紫杉肽和紫杉醇堿性條件下水解產(chǎn)物分析。通過紫杉肽在不同溶液中水解過稱研究發(fā)現(xiàn),紫杉醇和紫杉肽在pH13.0條件下易水解,生成一系列化合物,通過液相色譜方法對紫杉醇的系列水解產(chǎn)物分離純化,制備了約5.7 mg單一水解產(chǎn)物。通過質(zhì)譜和1H NMR初步推斷其結(jié)構(gòu),在購得相應(yīng)標準品后,通過UPLC、UV和MRM等方法對其結(jié)構(gòu)進行了確證,最終確定該水解產(chǎn)物為紫杉醇母核13’位上側(cè)鏈的羧酸鈉。分子式為：C16H14NNaO4;分子量為：307.08。4.紫杉肽中紫杉醇含量測定及方法學(xué)確證。紫杉肽和紫杉醇經(jīng)0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液水解后,以Agilent 1290 UPLC檢測分析,采用Waters BEH C18 (2.1× 50 mm,1.7μm)色譜柱,流動相為乙腈：水(10：90,v/v),檢測波長為227 nm。紫杉醇標準品經(jīng)水解后,與相同物質(zhì)的量濃度的紫杉醇C13側(cè)鏈標準品比較,結(jié)果測得峰面積之比與理論值的偏差為-0.70%,說明紫杉醇的水解反應(yīng)是徹底的；分析方法準確、重現(xiàn)性好,滿足藥典規(guī)定藥物含量測定方法學(xué)要求。測得5個批次紫杉肽中,每瓶中紫杉醇含量在31.80～37.38mg范圍內(nèi)。5.血漿樣品中紫杉肽分析方法的建立及方法學(xué)確證。紫杉肽樣品和紫杉醇溶液與人血漿混合后,用0.2 mol·L-1氫氧化鈉水解處理,再以兩倍體積乙腈除去樣品中的蛋白質(zhì)后,通過UPLC-MS/MS法檢測分析。通過對紫杉醇與紫杉肽共有的水解產(chǎn)物的測定,實現(xiàn)了對血漿樣品中紫杉肽的紫杉醇含量準確測定的目的。結(jié)果表明,該方法水解反應(yīng)穩(wěn)定徹底,靈敏度高,專屬性、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好,測得5個批次紫杉肽中,每瓶中紫杉醇含量在31.85～37.54 mg范圍內(nèi)。研究結(jié)論本研究所建立的紫杉肽中游離型紫杉醇和結(jié)合型紫杉醇含量測定方法簡單易行,且分析結(jié)果準確可靠,對紫杉肽的含量分析有一定參考意義,對同類紫杉醇的改進劑型的分析有一定的借鑒意義。
【關(guān)鍵詞】：紫杉醇 紫杉肽 定量分析 產(chǎn)物鑒定
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R917
【目錄】：

• 個人簡歷3-7
• 中英文縮略詞匯表7-8
• 摘要8-11
• ABSTRACT11-15
• 前言15-18
• 第一章 紫杉肽中游離紫杉醇含量測定及方法學(xué)確證18-27
• 1 實驗?zāi)康?/span>18
• 2 實驗材料18-19
• 2.1 藥品和試劑18
• 2.2 儀器18-19
• 3 實驗部分19-20
• 3.1 溶液制備19
• 3.2 紫杉醇標準曲線及質(zhì)控樣品的制備19-20
• 3.3 紫杉肽樣品處理20
• 3.4 HPLC檢測條件20
• 3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和處理20
• 4 實驗結(jié)果20-24
• 4.1 方法學(xué)確證20-24
• 4.2 紫杉肽樣品測定24
• 5 討論24-25
• 6 結(jié)論25-27
• 第二章 紫杉肽中結(jié)合型紫杉醇解離實驗27-35
• 1 實驗?zāi)康?/span>27
• 2 實驗材料27-28
• 2.1 藥品和試劑27
• 2.2 儀器27-28
• 3 實驗方法28-31
• 3.1 紫杉肽中結(jié)合型紫杉醇蛋白酶解離實驗28-29
• 3.2 紫杉肽中結(jié)合型紫杉醇酸堿解離實驗29-30
• 3.3 HPLC檢測條件30-31
• 3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和處理31
• 4 實驗結(jié)果31-33
• 4.1 紫杉肽中結(jié)合型紫杉醇蛋白酶解離實驗31
• 4.2 紫杉肽中結(jié)合型紫杉醇酸堿解離實驗31-33
• 5 討論33
• 6 結(jié)論33-35
• 第三章 紫杉肽和紫杉醇堿性條件下水解產(chǎn)物分析35-46
• 1 實驗?zāi)康?/span>35
• 2 實驗材料35-36
• 2.1 藥品和試劑35
• 2.2 儀器35-36
• 3 實驗部分36-44
• 3.1 溶液配制36
• 3.2 紫杉醇及紫杉肽水解產(chǎn)物的分離純化36-40
• 3.3 水解產(chǎn)物質(zhì)譜和核磁共振氫譜分析40-41
• 3.4 水解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)推斷41
• 3.5 水解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的確證41-44
• 4 討論44-45
• 5 結(jié)論45-46
• 第四章 紫杉肽中紫杉醇含量測定及方法學(xué)確證46-58
• 1 實驗?zāi)康?/span>46
• 2 實驗材料46-47
• 2.1 藥品和試劑46
• 2.2 儀器46-47
• 3 實驗部分47-49
• 3.1 溶液制備47
• 3.2 紫杉醇標準曲線的制備47-48
• 3.3 紫杉肽樣品處理48
• 3.4 UPLC檢測條件48-49
• 3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和處理49
• 4 實驗結(jié)果49-56
• 4.1 紫杉醇水解效率考察49-50
• 4.2 方法學(xué)考察50-56
• 4.3 紫杉肽樣品測定56
• 5 討論56-57
• 6 結(jié)論57-58
• 第五章 血漿樣品中紫杉肽分析方法的建立及確證58-73
• 1 實驗?zāi)康?/span>58
• 2 實驗材料58-59
• 2.1 藥品和試劑58
• 2.2 儀器58-59
• 3 實驗部分59-61
• 3.1 溶液制備59
• 3.2 紫杉醇標準曲線及質(zhì)控樣品的制備59-60
• 3.3 紫杉肽樣品處理60
• 3.4 UPLC-MS/MS檢測條件60-61
• 3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和處理61
• 4 實驗結(jié)果61-69
• 4.1 紫杉醇及紫杉肽水解反應(yīng)考察61-64
• 4.2 方法學(xué)確證64-69
• 4.3 紫杉肽樣品測定69
• 5 討論69-71
• 6 結(jié)論71-73
• 總結(jié)73-75
• 參考文獻75-79
• 綜述79-89
• 參考文獻84-89
• 致謝89-90
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)位論文90-93

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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7 朱坤賢;;我院藥物劑型臨床不合理使用現(xiàn)象分析[J];北方藥學(xué);2012年03期

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6 杜s嵞

本文編號：287641