本文關鍵詞：TSA對內(nèi)質網(wǎng)應激誘導線粒體損傷的影響及其機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：內(nèi)質網(wǎng)（Endoplasmic reticulum, ER）是真核細胞中一種重要的多功能膜性結構細胞器，在受到外界條件的刺激下產(chǎn)生內(nèi)質網(wǎng)應激（Endoplasmic reticulum stress,ERS），ERS時會適應性地激活未折疊蛋白反應(Unfolded protein response, UPR)以協(xié)助細胞的自身修復。然而，長時間的應激則最終會導致細胞凋亡。在內(nèi)質網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡中，線粒體的改變也扮演著重要角色，即線粒體與內(nèi)質網(wǎng)應激細胞的凋亡之間存在密切關系。 毒胡蘿卜素（Thapsigargin, TG）是一種常用的內(nèi)質網(wǎng)應激誘導劑，能特異性地抑制內(nèi)質網(wǎng)Ca2+-ATPases（SERCA）擾亂細胞的Ca2+穩(wěn)態(tài)，誘導細胞凋亡。在內(nèi)質網(wǎng)應激時，葡萄糖調節(jié)蛋白78(Glucose regulated protein78, GRP78)是細胞內(nèi)最先感受應激并激活UPR反應的蛋白。它最初被人們認為是一種存在于內(nèi)質網(wǎng)中的蛋白，然而最近的研究發(fā)現(xiàn)，GRP78可以在不同種類的細胞中定位于線粒體等多種細胞器，并在不同條件下發(fā)揮著不同的生物學功能。如文獻報道，小鼠腦腫瘤9L細胞在內(nèi)質網(wǎng)應激條件下，GRP78會從內(nèi)質網(wǎng)移位至線粒體，但其是否參與對應激細胞線粒體的保護并未進一步闡明。 線粒體是細胞中重要的能量代謝場所，由內(nèi)外兩層膜構成，通過三羧酸循環(huán)為細胞提供能量，維持細胞的正常生理功能。目前，對于ERS時細胞所執(zhí)行的與凋亡相關的分子機制已得到了十分廣泛的研究，但是在內(nèi)質網(wǎng)應激條件下，探究線粒體功能損傷的相關報道還不多見。 曲古菌素A（TrichostatinA, TSA）是一種廣譜的組蛋白去乙�；敢种苿梢酝ㄟ^抑制ERS細胞中的去乙�；富钚�，調節(jié)應激細胞的乙�；蕉{控相關基因的轉錄，保護應激細胞。已有研究表明，TSA在內(nèi)質網(wǎng)應激時通過升高蛋白GRP78、Bcl-2，降低CHOP的表達，起到對心肌細胞的保護作用。 由此可知，TSA可以保護內(nèi)質網(wǎng)應激細胞，而內(nèi)質網(wǎng)又與線粒體在功能上密切相關，所以我們猜想，TSA在保護內(nèi)質網(wǎng)應激細胞時，可能會通過與線粒體相關的途徑，減少細胞凋亡。 實驗目的： 本實驗擬探究在TG誘導ERS條件下，TSA對H9c2細胞與線粒體相關的保護機制。 實驗方法: 本實驗以H9c2細胞為研究對象，通過CCK-8實驗檢測內(nèi)質網(wǎng)應激誘導劑TG在不同劑量濃度下對H9c2細胞存活率的影響，并根據(jù)GRP78在不同時間的表達確定合理的應激誘導劑給藥時間；采用流式細胞術，檢測TSA在確定的濃度和時間條件下對內(nèi)質網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡的保護作用；采用JC-1染色法，并分別用熒光顯微鏡觀察和流式細胞術定量，觀察TSA對內(nèi)質網(wǎng)應激誘導的線粒體膜電勢降低的抑制作用；采用Western-blot法檢測與線粒體損傷相關指標CytC的表達改變；采用免疫熒光及Western-blot技術，檢測TSA對TG誘導的內(nèi)質網(wǎng)應激細胞中GRP78的表達改變；采取免疫熒光與細胞器染色方法，檢測GRP78蛋白在線粒體中的定位；采用亞細胞結構分離法，利用Western定量檢測定位于線粒體中的GRP78。 實驗結果： （1）TG工作濃度的確定：采用CCK-8法，TG對細胞的存活率呈劑量依賴性，其中1μM組存活率為：（88.31±3.60）%；2μM組的存活率為：（87.66±2.60）%，4μM組存活率為：（58.21±3.15）%，與對照組（98.23±2.1）%相比存在顯著性差異（P＜0.01），8μM組存活率為：（31.53±2.14）%，10μM組存活率為：（14.68±3.39）%，為進一步探究合理濃度，我們采取小濃度范圍，其中3μM組存活率為：（59.26±3.94）%，與對照組相比有顯著性差異（P＜0.01），所以我們接下來采用3μM為工作濃度。 （2）TG工作時間的確定：采用Western-blot檢測法，TG作用于細胞的時程變化中，0h、2h、4h三個時間點，GRP78的表達均無明顯變化，8h時為GRP78蛋白表達第一次顯著性升高，與對照組（97.22±2.91）%相比有顯著性差異（P＜0.05），而12小時與8小時差異不大，24h進一步顯著升高，所以我們采用8h為后續(xù)的工作時間。 （3）TSA對TG誘導的細胞凋亡的影響：采用流式細胞術觀察，其中TSA與TG合用組的細胞凋亡率為：(23.33±1.44)%，與TG組（39.23±0.42）%相比，具有顯著性差異（P＜0.05）。 （4）TSA對TG誘導線粒體膜電勢降低的作用：采用JC-1染色法并以熒光顯微鏡及流式檢測結果觀察發(fā)現(xiàn)，TSA可以抑制由TG誘導的線粒體膜電勢降低。流式細胞術結果表明，與單獨給予TG（37.32±0.35）組相比，TG與TSA合用組（15.76±0.28）能顯著抑制線粒體膜電勢的降低（P＜0.05）。 （5）TSA對TG誘導的CytC表達的影響：采用Western-blot法，與TG組相比，TSA與TG合用組會顯著降低應激細胞中CytC的表達的升高（P＜0.05）。 （6）TSA對內(nèi)質網(wǎng)應激細胞GRP78表達的影響：采用免疫熒光法和Western-blot法，其中與TG組相比，TSA與TG合用組能顯著升高細胞中GRP78的表達（P＜0.01）。 （7）TSA對GRP78在內(nèi)質網(wǎng)與線粒體中分布的影響：采用熒光染色法及亞細胞結構分離法定性并定量觀察，TSA與TG的合用能顯著增加定位于線粒體上的GRP78。 實驗結論： （1）TSA能抑制由TG誘導的內(nèi)質網(wǎng)應激下H9c2細胞凋亡； （2）TSA能通過抑制線粒體膜電勢降低、降低CytC表達干預內(nèi)質網(wǎng)應激條件下的線粒體損傷； （3）TSA可能由于增加內(nèi)質網(wǎng)應激下定位于線粒體的GRP78參與對線粒體損傷的保護。
【關鍵詞】：GRP78 內(nèi)質網(wǎng)應激 線粒體 TSA
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-15
• 第1章 文獻綜述15-26
• 1.1 內(nèi)質網(wǎng)應激15-17
• 1.1.1 內(nèi)質網(wǎng)功能15
• 1.1.2 內(nèi)質網(wǎng)應激15-16
• 1.1.3 未折疊蛋白反應與其相關信號機制16-17
• 1.2 線粒體17-20
• 1.2.1 線粒體結構17
• 1.2.2 線粒體功能17-18
• 1.2.3 線粒體與細胞凋亡18-19
• 1.2.4 線粒體膜電勢19
• 1.2.5 細胞色素 C19-20
• 1.3 GRP7820-21
• 1.3.1 GRP78 的細胞內(nèi)定位及相應功能20-21
• 1.4 內(nèi)質網(wǎng)與線粒體的 Cross-talk21-23
• 1.5 組蛋白乙�；揎椗c真核生物基因表達調控23-26
• 1.5.1 組蛋白修飾23-25
• 1.5.2 曲古菌素 A25-26
• 第2章 實驗材料與方法26-38
• 2.1 實驗用細胞株26
• 2.2 主要儀器設備26-27
• 2.3 主要試劑27-28
• 2.4 主要試劑的配制28-31
• 2.5 H9c2 細胞的培養(yǎng)31-32
• 2.6 CCK-8 檢測法32-33
• 2.7 Flow CytoMetry 檢測法33
• 2.8 Western Blot 檢測法33-35
• 2.9 免疫熒光染色法35-36
• 2.10 細胞器探針與免疫熒光染色法36-37
• 2.11 JC-1 熒光染色法37
• 2.12 亞細胞結構分離法37
• 2.14 統(tǒng)計學分析37-38
• 第3章 實驗結果38-50
• 3.1 TSA 對 TG 誘導內(nèi)質網(wǎng)應激細胞的保護作用38-42
• 3.1.1 TG 作用濃度的確定38-39
• 3.1.2 TG 作用時間的確定39-40
• 3.1.3 TSA 對 TG 誘導細胞凋亡的影響40-42
• 3.2 TSA 對 TG 誘導線粒體損傷的影響42-45
• 3.2.1 TSA 對 TG 誘導線粒體膜電勢降低的作用42-44
• 3.2.2 TSA 對 TG 誘導的 CytC 表達的影響44-45
• 3.3 TSA 對內(nèi)質網(wǎng)應激細胞 GRP78 表達與分布的影響45-50
• 3.3.1 TSA 對內(nèi)質網(wǎng)應激細胞 GRP78 表達的影響45-46
• 3.3.2 TSA 對內(nèi)質網(wǎng)與線粒體中 GRP78 的影響定性觀察46-48
• 3.3.3 TSA 對 TG 誘導線粒體中 GRP78 的影響定量觀察48-50
• 第4章 討論50-53
• 第5章 結論53-54
• 參考文獻54-62
• 致謝62

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 關麗英;許彩民;潘華珍;;內(nèi)質網(wǎng)應激介導的細胞凋亡[J];生物化學與生物物理進展;2007年11期

2 門秀麗;張麗萍;吳靜;劉虹麟;張文健;婁晉寧;;線粒體形態(tài)與細胞凋亡的關系[J];生理科學進展;2012年05期

3 Thekkuttuparambil Ananthanarayanan Ajith;Thankamani Gopinathan Jayakumar;;Mitochondria-targeted agents: Future perspectives of mitochondrial pharmaceutics in cardiovascular diseases[J];World Journal of Cardiology;2014年10期

  本文關鍵詞：TSA對內(nèi)質網(wǎng)應激誘導線粒體損傷的影響及其機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：279708