發(fā)布時(shí)間：2017-03-31 14:13

  本文關(guān)鍵詞：TSA對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)線粒體損傷的影響及其機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic reticulum, ER）是真核細(xì)胞中一種重要的多功能膜性結(jié)構(gòu)細(xì)胞器，在受到外界條件的刺激下產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress,ERS），ERS時(shí)會(huì)適應(yīng)性地激活未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response, UPR)以協(xié)助細(xì)胞的自身修復(fù)。然而，長(zhǎng)時(shí)間的應(yīng)激則最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，線粒體的改變也扮演著重要角色，即線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞的凋亡之間存在密切關(guān)系。 毒胡蘿卜素（Thapsigargin, TG）是一種常用的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑，能特異性地抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATPases（SERCA）擾亂細(xì)胞的Ca2+穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose regulated protein78, GRP78)是細(xì)胞內(nèi)最先感受應(yīng)激并激活UPR反應(yīng)的蛋白。它最初被人們認(rèn)為是一種存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白，然而最近的研究發(fā)現(xiàn)，GRP78可以在不同種類的細(xì)胞中定位于線粒體等多種細(xì)胞器，并在不同條件下發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能。如文獻(xiàn)報(bào)道，小鼠腦腫瘤9L細(xì)胞在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，GRP78會(huì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)移位至線粒體，但其是否參與對(duì)應(yīng)激細(xì)胞線粒體的保護(hù)并未進(jìn)一步闡明。 線粒體是細(xì)胞中重要的能量代謝場(chǎng)所，由內(nèi)外兩層膜構(gòu)成，通過三羧酸循環(huán)為細(xì)胞提供能量，維持細(xì)胞的正常生理功能。目前，對(duì)于ERS時(shí)細(xì)胞所執(zhí)行的與凋亡相關(guān)的分子機(jī)制已得到了十分廣泛的研究，但是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，探究線粒體功能損傷的相關(guān)報(bào)道還不多見。 曲古菌素A（TrichostatinA, TSA）是一種廣譜的組蛋白去乙�；敢种苿�，可以通過抑制ERS細(xì)胞中的去乙�；富钚�，調(diào)節(jié)應(yīng)激細(xì)胞的乙�；蕉{(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，保護(hù)應(yīng)激細(xì)胞。已有研究表明，TSA在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)通過升高蛋白GRP78、Bcl-2，降低CHOP的表達(dá)，起到對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。 由此可知，TSA可以保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)又與線粒體在功能上密切相關(guān)，所以我們猜想，TSA在保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞時(shí)，可能會(huì)通過與線粒體相關(guān)的途徑，減少細(xì)胞凋亡。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?本實(shí)驗(yàn)擬探究在TG誘導(dǎo)ERS條件下，TSA對(duì)H9c2細(xì)胞與線粒體相關(guān)的保護(hù)機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法: 本實(shí)驗(yàn)以H9c2細(xì)胞為研究對(duì)象，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TG在不同劑量濃度下對(duì)H9c2細(xì)胞存活率的影響，并根據(jù)GRP78在不同時(shí)間的表達(dá)確定合理的應(yīng)激誘導(dǎo)劑給藥時(shí)間；采用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)TSA在確定的濃度和時(shí)間條件下對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用；采用JC-1染色法，并分別用熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)定量，觀察TSA對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體膜電勢(shì)降低的抑制作用；采用Western-blot法檢測(cè)與線粒體損傷相關(guān)指標(biāo)CytC的表達(dá)改變；采用免疫熒光及Western-blot技術(shù)，檢測(cè)TSA對(duì)TG誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞中GRP78的表達(dá)改變；采取免疫熒光與細(xì)胞器染色方法，檢測(cè)GRP78蛋白在線粒體中的定位；采用亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離法，利用Western定量檢測(cè)定位于線粒體中的GRP78。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： （1）TG工作濃度的確定：采用CCK-8法，TG對(duì)細(xì)胞的存活率呈劑量依賴性，其中1μM組存活率為：（88.31±3.60）%；2μM組的存活率為：（87.66±2.60）%，4μM組存活率為：（58.21±3.15）%，與對(duì)照組（98.23±2.1）%相比存在顯著性差異（P＜0.01），8μM組存活率為：（31.53±2.14）%，10μM組存活率為：（14.68±3.39）%，為進(jìn)一步探究合理濃度，我們采取小濃度范圍，其中3μM組存活率為：（59.26±3.94）%，與對(duì)照組相比有顯著性差異（P＜0.01），所以我們接下來采用3μM為工作濃度。 （2）TG工作時(shí)間的確定：采用Western-blot檢測(cè)法，TG作用于細(xì)胞的時(shí)程變化中，0h、2h、4h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，GRP78的表達(dá)均無明顯變化，8h時(shí)為GRP78蛋白表達(dá)第一次顯著性升高，與對(duì)照組（97.22±2.91）%相比有顯著性差異（P＜0.05），而12小時(shí)與8小時(shí)差異不大，24h進(jìn)一步顯著升高，所以我們采用8h為后續(xù)的工作時(shí)間。 （3）TSA對(duì)TG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響：采用流式細(xì)胞術(shù)觀察，其中TSA與TG合用組的細(xì)胞凋亡率為：(23.33±1.44)%，與TG組（39.23±0.42）%相比，具有顯著性差異（P＜0.05）。 （4）TSA對(duì)TG誘導(dǎo)線粒體膜電勢(shì)降低的作用：采用JC-1染色法并以熒光顯微鏡及流式檢測(cè)結(jié)果觀察發(fā)現(xiàn)，TSA可以抑制由TG誘導(dǎo)的線粒體膜電勢(shì)降低。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，與單獨(dú)給予TG（37.32±0.35）組相比，TG與TSA合用組（15.76±0.28）能顯著抑制線粒體膜電勢(shì)的降低（P＜0.05）。 （5）TSA對(duì)TG誘導(dǎo)的CytC表達(dá)的影響：采用Western-blot法，與TG組相比，TSA與TG合用組會(huì)顯著降低應(yīng)激細(xì)胞中CytC的表達(dá)的升高（P＜0.05）。 （6）TSA對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞GRP78表達(dá)的影響：采用免疫熒光法和Western-blot法，其中與TG組相比，TSA與TG合用組能顯著升高細(xì)胞中GRP78的表達(dá)（P＜0.01）。 （7）TSA對(duì)GRP78在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體中分布的影響：采用熒光染色法及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離法定性并定量觀察，TSA與TG的合用能顯著增加定位于線粒體上的GRP78。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： （1）TSA能抑制由TG誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下H9c2細(xì)胞凋亡； （2）TSA能通過抑制線粒體膜電勢(shì)降低、降低CytC表達(dá)干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下的線粒體損傷； （3）TSA可能由于增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下定位于線粒體的GRP78參與對(duì)線粒體損傷的保護(hù)。
【關(guān)鍵詞】：GRP78 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 線粒體 TSA
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-15
• 第1章 文獻(xiàn)綜述15-26
• 1.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激15-17
• 1.1.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能15
• 1.1.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激15-16
• 1.1.3 未折疊蛋白反應(yīng)與其相關(guān)信號(hào)機(jī)制16-17
• 1.2 線粒體17-20
• 1.2.1 線粒體結(jié)構(gòu)17
• 1.2.2 線粒體功能17-18
• 1.2.3 線粒體與細(xì)胞凋亡18-19
• 1.2.4 線粒體膜電勢(shì)19
• 1.2.5 細(xì)胞色素 C19-20
• 1.3 GRP7820-21
• 1.3.1 GRP78 的細(xì)胞內(nèi)定位及相應(yīng)功能20-21
• 1.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體的 Cross-talk21-23
• 1.5 組蛋白乙�；揎椗c真核生物基因表達(dá)調(diào)控23-26
• 1.5.1 組蛋白修飾23-25
• 1.5.2 曲古菌素 A25-26
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法26-38
• 2.1 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株26
• 2.2 主要儀器設(shè)備26-27
• 2.3 主要試劑27-28
• 2.4 主要試劑的配制28-31
• 2.5 H9c2 細(xì)胞的培養(yǎng)31-32
• 2.6 CCK-8 檢測(cè)法32-33
• 2.7 Flow CytoMetry 檢測(cè)法33
• 2.8 Western Blot 檢測(cè)法33-35
• 2.9 免疫熒光染色法35-36
• 2.10 細(xì)胞器探針與免疫熒光染色法36-37
• 2.11 JC-1 熒光染色法37
• 2.12 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離法37
• 2.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析37-38
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-50
• 3.1 TSA 對(duì) TG 誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞的保護(hù)作用38-42
• 3.1.1 TG 作用濃度的確定38-39
• 3.1.2 TG 作用時(shí)間的確定39-40
• 3.1.3 TSA 對(duì) TG 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響40-42
• 3.2 TSA 對(duì) TG 誘導(dǎo)線粒體損傷的影響42-45
• 3.2.1 TSA 對(duì) TG 誘導(dǎo)線粒體膜電勢(shì)降低的作用42-44
• 3.2.2 TSA 對(duì) TG 誘導(dǎo)的 CytC 表達(dá)的影響44-45
• 3.3 TSA 對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞 GRP78 表達(dá)與分布的影響45-50
• 3.3.1 TSA 對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞 GRP78 表達(dá)的影響45-46
• 3.3.2 TSA 對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體中 GRP78 的影響定性觀察46-48
• 3.3.3 TSA 對(duì) TG 誘導(dǎo)線粒體中 GRP78 的影響定量觀察48-50
• 第4章 討論50-53
• 第5章 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-62
• 致謝62

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 關(guān)麗英;許彩民;潘華珍;;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2007年11期

2 門秀麗;張麗萍;吳靜;劉虹麟;張文健;婁晉寧;;線粒體形態(tài)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2012年05期

3 Thekkuttuparambil Ananthanarayanan Ajith;Thankamani Gopinathan Jayakumar;;Mitochondria-targeted agents: Future perspectives of mitochondrial pharmaceutics in cardiovascular diseases[J];World Journal of Cardiology;2014年10期

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本文編號(hào)：279708