本文關(guān)鍵詞：基于AID酶與哺乳動物細胞展示技術(shù)的抗PD-1抗體體外進化研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景:抗體作為一種特異性強、安全性高、效果顯著的藥物,在腫瘤等多種疾病的臨床治療中發(fā)揮重要作用。在多種抗體制備技術(shù)中,抗體庫技術(shù)是最常用的技術(shù)之一�；罨T導胞嘧啶核苷脫氨酶(activation-induced cytidine deaminase AID)參與B細胞受體親和力成熟,促進并誘導免疫球蛋白可變區(qū)的突變,在抗體體內(nèi)成熟過程中發(fā)揮重要作用。文獻報道,在抗體庫中引入AID酶,有助于提高抗體庫庫容。因此,AID酶與抗體庫技術(shù)相結(jié)合的抗體篩選技術(shù)成為當前抗體篩選的一個研究熱點。免疫負調(diào)控的共刺激信號通路PD-1/PD-L1在腫瘤的免疫逃逸中發(fā)揮著重要的作用,PD-1、PD-L1并成為腫瘤免疫治療的新靶點�？筆D-1/PD-L1的抗體藥物也成為了新的研究熱點。目的:在課題組前期搭建的“哺乳動物細胞展示抗體庫技術(shù)”基礎上,本研究以PD-1為靶點,將抗體庫技術(shù)與AID酶誘導抗體基因體外進化成熟相結(jié)合,借助流式細胞分選技術(shù),探討了一種高通量的抗體篩選新方法。方法:通過IMGT獲得抗PD-1抗體Nivolumab的可變區(qū)氨基酸序列,合理考察密碼子偏性的前提下進行反向翻譯獲得可變區(qū)基因序列;通過全合成制備Nivolumab的輕重鏈基因,并克隆入pFRT-IgG1載體中進行表達,全抗體命名為MIL75。將MIL75抗體Fab片段克隆至pFRT-FTMK載體上,該載體在抗體Fab片段的重鏈C末端偶聯(lián)了PDGFR-α跨膜區(qū),使抗體Fab片段能夠展示在細胞膜上。通過真核細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體轉(zhuǎn)染到CHO-K1-FRT細胞中并篩選穩(wěn)定表達細胞株,進一步將含有AID酶基因的載體轉(zhuǎn)染至穩(wěn)定表達細胞中。利用FITC標記的PD-1抗原(PD-1-FITC),通過流式分選的方法篩選高親和力的抗體。將富集到的細胞提取基因組,調(diào)取抗體基因經(jīng)測序并克隆到全長抗體表達載體pFRT-IgG1上進行表達。隨后對篩選得到的抗體進行了初步功能評價:(1)利用ELISA和Biacore的方法評價了抗體與抗原結(jié)合的特異性和親和力;(2)針對篩選獲得的高親和力抗體,借助混合淋巴細胞反應實驗,通過檢測T細胞分泌IFN-γ的水平來評價抗體激活T細胞的功能;(3)在免疫缺陷NPG小鼠中輸注人PMBC,構(gòu)建GVHD模型,進一步給予抗PD-1抗體,通過免疫排斥反應的強弱評價抗體體內(nèi)生物學活性。結(jié)果:(1)將全合成的抗體可變區(qū)基因分別克隆入載體pFRT-IgG1以及pFRTFTMK中,成功構(gòu)建MIL75全長抗體表達載體pFRT-IgG1K-MIL75以及Fab抗體細胞膜展示載體pFRT-FTMK-MIL75Fab。pFRT-IgG1K-MIL75穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO-K1-FRT細胞后,經(jīng)過加壓篩選,獲得了MIL75全長抗體穩(wěn)定表達細胞株。ELISA結(jié)果表明,表達的MIL75抗體可以特異性、高親和力識別PD-1抗原。pFRT-FTMK-MIL75Fab穩(wěn)定轉(zhuǎn)染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO-K1-FRT細胞后,經(jīng)過加壓篩選,獲得穩(wěn)定表達MIL75-Fab的細胞株。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,MIL75-Fab成功展示在CHO-K1-FRT細胞表面,且能與抗原PD-1的特異性結(jié)合并具有濃度依賴性;進一步轉(zhuǎn)染入AID酶誘導突變。(2)經(jīng)流式篩選及計算機序列比對分析后獲得三條新的抗體序列,分別為Fv56、Fv60、Fv70。(3)體外結(jié)合實驗表明Fv56、Fv60、Fv70三株抗體均能夠與靶抗原PD-1特異性結(jié)合;其中,Fv56、Fv60識別的表位與MIL75相同;Fv70識別的表位發(fā)生了漂移。抗體Fv56、Fv60在體外能夠特異性阻斷PD-1與PD-L1相互作用。進一步的生物學功能實驗表明:Fv56、Fv60與母本抗體MIL75具有相似的生物學活性,均能夠激活T細胞,上調(diào)T細胞分泌IFN-γ,并具有一定的抗體濃度依賴性;而Fv70只在高濃度下對T細胞具有激活功能。(4)體內(nèi)生物學功能實驗結(jié)果顯示抗體Fv56能夠激活人源化小鼠體內(nèi)的T細胞,加劇免疫排斥反應,縮短了小鼠的生存時間。結(jié)論:本研究將哺乳動物細胞展示技術(shù)與AID酶誘導抗體親和力成熟相結(jié)合,建立了一種能夠快速有效進行體外抗體進化的篩選技術(shù)。并以PD-1為靶點,通過這種方法篩選得到了三株新的抗體Fv56、Fv60和Fv70;其中Fv56、Fv60兩株抗體具有良好的T細胞激活功能,其生物學活性與母本抗體MIL75相似。
【關(guān)鍵詞】：抗體 哺乳動物細胞展示技術(shù) AID酶 PD-1
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 縮略詞表11-13
• 引言13-17
• 第一部分 MIL75FAB在哺乳動物細胞表面展示及母本抗體MIL75表達純化17-31
• 1.實驗目的17
• 2.材料與方法17-21
• 2.1 材料17-18
• 2.2 方法18-21
• 3.結(jié)果21-27
• 3.1 MIL75基因合成21-22
• 3.2 pFRT-IgG1K-MIL75和pFRT-FTMK-MIL75Fab表達載體的構(gòu)建22-23
• 3.3 MIL75的表達23-24
• 3.4 MIL75的純化及鑒定24-26
• 3.5 MIL75-Fab穩(wěn)定展示細胞株的流式鑒定26-27
• 3.6 AID酶的表達27
• 4.討論27-29
• 第一部分 小結(jié)29-31
• 第二部分 基于AID酶的抗體篩選31-45
• 1.實驗目的31
• 2.材料與方法31-35
• 2.1 材料31-32
• 2.2 方法32-35
• 3.結(jié)果35-42
• 3.1 基于AID酶 的MIL75Fab抗體庫的鑒定35-36
• 3.2 流式篩選新的抗PD-1 的抗體36-38
• 3.3 序列分析確定了三株新的抗PD-1 的抗體38-39
• 3.4 FV56，F(xiàn)V60，F(xiàn)V70全長表達載體的構(gòu)建39-40
• 3.5 FV56，，F(xiàn)V60，F(xiàn)V70的瞬時表達40
• 3.6 三株新抗體的表達純化40-42
• 4.討論42-43
• 第二部分 小結(jié)43-45
• 第三部分 抗體的體內(nèi)外活性評價45-59
• 1.實驗目的45
• 2.材料方法45-49
• 2.1 材料45-46
• 2.2 方法46-49
• 3. 結(jié)果49-55
• 3.1 新篩選的抗體能夠結(jié)合其抗原PD-149
• 3.2 新篩選的抗體不能與CD28家族其他分子結(jié)合49-50
• 3.3 新篩選的抗體親和力的鑒定50-51
• 3.4 FV56、FV60和FV70識別抗原表位的鑒定51-52
• 3.5 FV56、FV60和FV70阻斷PD-1/PDL1相互作用52
• 3.6 抗體的體外生物活性52-54
• 3.7 FV56與MIL75的體內(nèi)生物學活性54-55
• 4.討論55-57
• 第三部分 小結(jié)57-59
• 全文總結(jié)59-61
• 參考文獻61-63
• 綜述63-75
• 參考文獻71-75
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文目錄75-76
• 致謝76-77

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本文編號：274281