【摘要】：高原自然環(huán)境的特點是低壓、低氧、氣候干燥寒冷及紫外線強(qiáng)等,其中低氧是影響人體的重要因素。這種低氧環(huán)境會影響藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過程,然而目前高原用藥的方式和劑量與平原無異,這會影響高原人群用藥的安全性和有效性。藥物代謝酶作為藥物在體內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的重要工具,在藥物的解毒和轉(zhuǎn)化過程中起重要作用。目前關(guān)于低氧狀態(tài)下藥物代謝酶的調(diào)控機(jī)制尚不明確,因此探究一些調(diào)控因素對酶的調(diào)控作用非常必要。CYP3A4(大鼠體內(nèi)為CYP3A1)和UGT1A1是人體內(nèi)最重要的藥物代謝酶,能夠代謝臨床50%以上的藥物,所以本實驗選取CYP3A1和UGT1A1作為I相代謝酶和II相代謝酶的代表,考察急進(jìn)高原后大鼠肝臟內(nèi)兩個藥物代謝酶的變化情況,并結(jié)合兩個調(diào)控因素核受體和細(xì)胞因子的變化對機(jī)制進(jìn)行探討。本研究將大鼠急進(jìn)至青海玉樹(海拔4010m)進(jìn)行低氧處理,待低氧不同時間(12h、24h、36h、48h)進(jìn)行實驗,對照組大鼠在甘肅蘭州(海拔1500m)正常喂養(yǎng)。本課題主要從以下幾個部分進(jìn)行研究:(1)考察高原低氧環(huán)境對大鼠肝臟的影響。分析對照組和低氧不同時間組大鼠的血氣、生化指標(biāo),摘取肝臟做病理切片觀察組織病理改變;(2)探究高原低氧環(huán)境對大鼠肝臟內(nèi)藥物代謝酶CYP3A1和UGT1A1表達(dá)的影響,用Real-time PCR檢測mRNA表達(dá)的變化,用Western-blot檢測蛋白表達(dá)的變化;(3)研究高原低氧環(huán)境對藥物代謝酶調(diào)控因素核受體(PXR和CAR)和細(xì)胞因子的影響,用Real-time PCR和Western-blot檢測核受體PXR和CAR的表達(dá)變化,用蛋白芯片技術(shù)檢測肝組織細(xì)胞因子的含量變化,并分析兩種調(diào)控因素與藥物代謝酶的相關(guān)性;(4)在細(xì)胞實驗中進(jìn)行機(jī)制驗證,控制單一變量驗證調(diào)控因素對藥物代謝酶的調(diào)控。第一部分結(jié)果表明:大鼠急進(jìn)高原后血液中可利用氧氣濃度降低,pH值降低,酶類物質(zhì)ALT和AST增加,總蛋白降低,提示肝組織發(fā)生生理性變化;肝臟病理結(jié)果顯示,高原組大鼠肝細(xì)胞輕度壞死,周圍血管輕微充血,中央靜脈水腫且伴有炎性浸潤,說明肝臟功能可能受損。肝臟作為藥物代謝的主要器官,其功能的受損對藥物代謝酶的合成、表達(dá)等均會產(chǎn)生影響,進(jìn)而影響藥物代謝過程。第二部分結(jié)果表明:大鼠急進(jìn)高原后肝臟內(nèi)CYP3A1和UGT1A1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低,說明在高原環(huán)境中部分藥物在體內(nèi)的代謝將會減慢,清除速率降低,藥物在體內(nèi)駐留時間延長,進(jìn)而有可能增加藥物毒性。第三部分結(jié)果表明:代謝型核受體PXR和CAR的mRNA表達(dá)水平從低氧12h后即顯著降低,綜合文獻(xiàn)可以推測在高原低氧狀態(tài)下PXR和CAR可能作為這兩種酶的上游基因而調(diào)控CYP3A1和UGT1A1的轉(zhuǎn)錄;蛋白芯片結(jié)果表明,大鼠急進(jìn)高原后肝組織內(nèi)IFN-γ、IL-4和IL-6的表達(dá)量在低氧48h后有顯著升高,而IL-10、IL-13和MCP-1在低氧24h后就顯著升高。通過相關(guān)性分析得出結(jié)論:IFN-γ、IL-6與CYP3A1高度負(fù)相關(guān),IL-6與UGT1A1高度負(fù)相關(guān),在第四部分的細(xì)胞實驗中驗證該相關(guān)性,確定IFN-γ和IL-6對CYP3A1和UGT1A1的調(diào)控作用。第四部分結(jié)果表明:IFN-γ孵育BRL大鼠正常肝細(xì)胞12h后CYP3A1、UGT1A1的mRNA表達(dá)顯著降低,但隨著孵育時間的延長,其mRNA表達(dá)逐漸升高,有上調(diào)趨勢,蛋白表達(dá)趨于正常。IFN-γ相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子STAT1的mRNA表達(dá)顯著增加,說明IFN-γ的調(diào)控作用可能通過蛋白激酶STAT1的激活來實現(xiàn)的。而IL-6在低氧狀態(tài)孵育12h、24h后CYP3A1的mRNA表達(dá)顯著降低,UGT1A1的mRNA表達(dá)在孵育12h后顯著降低,隨著孵育時間的延長,CYP3A1和UGT1A1的mRNA表達(dá)水平有上升后又回復(fù)正常的過程。IL-6孵育48h后,UGT1A1的蛋白表達(dá)顯著降低,CYP3A1無顯著變化。為了探究IL-6的調(diào)控機(jī)制,我們研究了IL-6相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達(dá),發(fā)現(xiàn)C/EBPβ的表達(dá)在36h時顯著升高,說明C/EBPβ參與了IL-6對藥物代謝酶的調(diào)控。整個實驗結(jié)果說明在低氧狀態(tài)下IFN-γ和IL-6參與CYP3A1和UGT1A1的調(diào)控,但這種調(diào)控與時間關(guān)系密切,隨著孵育時間的延長,可能調(diào)動了細(xì)胞的反饋機(jī)制促使酶的表達(dá)趨于正常。本研究通過動物實驗和整體實驗研究了高原低氧環(huán)境對藥物代謝酶CYP3A1和UGT1A1的調(diào)控作用,可以得出結(jié)論:大鼠急進(jìn)高原后肝臟產(chǎn)生炎性反應(yīng),這是抑制藥物代謝酶CYP3A1和UGT1A1表達(dá)的主要因素。此外,核受體PXR和CAR也可能參與了CYP3A1和UGT1A1的調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R96

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本文編號：2700991