【摘要】：腫瘤缺氧是實(shí)體瘤的關(guān)鍵特征之一,它可為誘發(fā)遞送納米藥物遞送系統(tǒng)的可控釋藥以增強(qiáng)抗腫瘤療效。缺氧敏感性納米療法主要涉及三類。第一類是用包埋在納米載體中的前體藥物(例如替拉扎明)在缺氧微環(huán)境中被激活,從而具有抗腫瘤活性,實(shí)現(xiàn)缺氧敏感的腫瘤治療。第二類是利用偶氮苯作為缺氧敏感性載體的連接分子,常用于構(gòu)建脂質(zhì)體、聚合物囊泡或其它類型的納米載體中。在缺氧的觸發(fā)下,這些納米載體會因偶氮基團(tuán)的斷裂而崩解。第三類是基于含有硝基咪唑(2-Nitroimidazole,2-NI)的缺氧敏感納米載體,該基元可以在缺氧的腫瘤細(xì)胞中被還原,還原過程主要涉及的是咪唑環(huán)連接的硝基基團(tuán),最終生成氨基咪唑以及乙二醛衍生物。在缺氧刺激下,疏水性的硝基咪唑在細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性的氨基咪唑,進(jìn)而引發(fā)納米載體的崩解和藥物的釋放。通常的做法是將硝基咪唑與不同的材料共價(jià)相連,常用的材料包括殼聚糖、羧甲基葡聚糖、烷基化聚乙烯亞胺、可離子化脂質(zhì)和兩親性肽聚合物。這些硝基咪唑修飾的(大)分子可以自組裝形成各類缺氧敏感的納米載體。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo),腫瘤組織內(nèi)部的缺氧程度是不均勻的(即缺氧異質(zhì)性)。氧氣的含量在很大程度上決定了硝基咪唑修飾的納米載體的釋藥速率和程度,因此缺氧異質(zhì)性會影響缺氧敏感型納米載體的遞送效率,導(dǎo)致抗腫瘤療效降低。為解決這一問題,研究者們開發(fā)了一種光誘導(dǎo)型納米系統(tǒng),它可以誘導(dǎo)形成缺氧微環(huán)境或通過增加氧氣消耗來加劇缺氧的程度。這些納米制劑常選擇運(yùn)用光敏劑(例如二氫卟吩e6,Chlorin e6,Ce6)或類似的結(jié)構(gòu)單元(例如二噻吩-苯并三唑)以實(shí)現(xiàn)該功能。即使在氧含量正�；蛉毖醭潭容^低的情況下,光敏劑可以在激光的照射下把周圍的氧氣轉(zhuǎn)變成單線態(tài)氧從而維持一定的低氧環(huán)境來促進(jìn)納米載體的分解,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)藥物的應(yīng)答釋放并快速達(dá)到細(xì)胞內(nèi)最低有效藥物濃度。然而,我們猜想在該體系中引入的單線態(tài)氧可能與硝基咪唑發(fā)生化學(xué)相互作用。據(jù)本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),單線態(tài)氧可以將疏水性的咪唑轉(zhuǎn)化為親水性的尿素并導(dǎo)致聚合物-咪唑共軛膠束的崩解。由于各咪唑化合物是單線態(tài)氧的優(yōu)良猝滅劑,我們推測硝基咪唑也可能通過咪唑氧化途徑與單線態(tài)氧發(fā)生反應(yīng)。因此帶有硝基咪唑的納米載體可能是缺氧和單線態(tài)氧-雙重響應(yīng),這將有利于克服腫瘤部位缺氧異質(zhì)性導(dǎo)致藥物釋放速率及胞內(nèi)藥物濃度的巨大差異。因此,本課題的目的是研究體外單線態(tài)氧和帶有硝基咪唑的膠束之間的相互作用機(jī)理。有別于之前側(cè)重缺氧敏感納米膠束的應(yīng)用性研究,我們目前的工作是試圖闡明單線態(tài)氧氧化硝基咪唑的機(jī)理,是一項(xiàng)基礎(chǔ)研究。為了實(shí)現(xiàn)這一目的,我們將硝基咪唑與兩親性甲氧基聚(乙二醇)-聚(天冬氨酸)(mPEG-PAsp)共聚物的側(cè)鏈共價(jià)結(jié)合,最終制備出的共聚物可在水溶液中自組裝成膠束。將光敏劑Ce6物理包載于膠束內(nèi),用于產(chǎn)生單線態(tài)氧的模型藥物。另外,使用包載相同光敏劑的甲氧基聚(乙二醇)-聚(β-芐基-L-天冬氨酸)(mPEG-PBLA)膠束(CM)作為實(shí)驗(yàn)的負(fù)對照。為了將硝基咪唑部分共價(jià)連接到mPEG-PAsp共聚物的側(cè)鏈,我們合成了含有氨基的硝基咪唑衍生物(NI-NH_2)。通過核磁共振氫譜,核磁共振碳譜和質(zhì)譜分析證實(shí)了NI-NH_2的成功合成。mPEG-PBLA共聚物是通過聚乙二醇與天冬氨酸N-羧酸酐單體(BLA-NCA)的開環(huán)聚合合成的,其結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振氫譜和紅外光譜法確認(rèn)。mPEG-PBLA的平均分子量為7,220 Da,疏水鏈段的重復(fù)數(shù)為約10。在堿性條件下芐基去保護(hù)后得到mPEG-PAsp,之后NI通過酰胺化反應(yīng)與聚合物主鏈的聚天冬氨酸共價(jià)結(jié)合最終獲得的嵌段共聚物mPEG-PAsp-NI(分子量7,820 Da)。高分子聚合物mPEG-PAsp-NI與小分子NI表現(xiàn)出類似紫外-可見吸收光譜,這間接證明了NI與高分子主鏈的成功連接。響應(yīng)型膠束(Responsive micelle,RM)的臨界膠束濃度為12.0±0.3μg/mL,這與具有相同聚合物主鏈的咪唑聚合物膠束非常相近。在給藥后,具有較低CMC的膠束由于穩(wěn)定性高,因而具有較長的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。Ce6在膠束中的負(fù)載量分別為3.7±0.3%w/w(mPEG-PAsp-NI)和1.0±0.1%w/w(mPEG-PBLA)。響應(yīng)型膠束的藥物負(fù)載能力與非響應(yīng)型膠束(Control micelle,CM)的負(fù)載能力一致。由于存在載體與藥物之間的氫鍵相互作用,我們推測RM具有優(yōu)于對照膠束CM的載藥能力。與咪唑類似,NI也是一種有效的氫鍵受體。由于Ce6包含多個(gè)氫供體(例如-COOH),氫鍵的形成可以增強(qiáng)載體和藥物之間的相互作用,導(dǎo)致膠束內(nèi)的Ce6載藥量增加。我們測得的膠束載藥量與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的納米粒子的載藥量(5%)相一致。在包載Ce6之后,膠束的半徑有略微的增加,這是由于藥物的存在占據(jù)了膠束內(nèi)核中心的一部分空間而引起尺寸擴(kuò)大。和空白RM相比,RM/Ce6的表面電荷絕對值顯著增大。我們推斷有相當(dāng)多的Ce6積累在了膠束的疏水核心和親水殼界面上。盡管Ce6的Log P(4.6)值很大,但它的結(jié)構(gòu)中也含有三個(gè)羧基(pKa=4.0)。這些羧基在中性條件下的電離會增強(qiáng)Ce6的親水性及其向核-殼界面的轉(zhuǎn)移。在離子化之后,羧基會轉(zhuǎn)化為帶負(fù)電的離子形式形式,最終導(dǎo)致膠束表面電荷的改變。基于單線態(tài)氧誘導(dǎo)的從疏水咪唑到親水性尿素轉(zhuǎn)化的反應(yīng),我們提出了NI與單線態(tài)氧反應(yīng)后生成草酰醛和硝基甲酰胺的反應(yīng)機(jī)理。質(zhì)譜MS分析證實(shí)了反應(yīng)中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物的存在,這直接證明了該機(jī)理的正確性。通過醛基特異性的熒光分析,我們進(jìn)一步證實(shí)了草酰醛的形成。經(jīng)過波長為660 nm的激光照射后,Ce6產(chǎn)生的單線態(tài)氧可將硝基咪唑氧化為草酰醛,其可與2,2'-呋喃甲醛反應(yīng)產(chǎn)生熒光二氟乙基咪唑,反應(yīng)產(chǎn)物可以在355 nm處檢測到其熒光吸收。當(dāng)沒有激光照射(即沒有單線態(tài)氧產(chǎn)生)時(shí),沒有發(fā)現(xiàn)二氟乙基咪唑的熒光吸收。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顯著熒光對比也從側(cè)面支持了我們假設(shè)的機(jī)理。之后我們通過核磁共振氫譜進(jìn)一步分析單線態(tài)氧和硝基咪唑之間的反應(yīng)。在光照的條件下,對于小分子(NI)和含有NI的聚合物共軛物,NI的特征質(zhì)子峰的積分面積隨著Ce6濃度(即單線態(tài)氧濃度)的增加而持續(xù)下降。然而,在該實(shí)驗(yàn)條件下,基于核磁共振氫譜分析,NI-醛轉(zhuǎn)化的最大程度為65%。盡管這NI氧化與咪唑氧化都必須首先形成內(nèi)過氧化物氧化產(chǎn)物,但硝基部分的存在可能阻礙內(nèi)過氧化物鍵的分解并阻止內(nèi)過氧化物進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌虚g體和最終產(chǎn)物。咪唑內(nèi)過氧化物環(huán)中有兩個(gè)氫,而NI內(nèi)過氧化物中只有一個(gè)氫;由于體內(nèi)過氧化物的分解依賴于堿對NI中氫的攻擊,所以硝基的存在將堿攻擊的幾率降低到50%,從而導(dǎo)致了從NI到醛的相對不完全轉(zhuǎn)化。盡管如此,所有上述數(shù)據(jù)都說明了疏水性NI可以轉(zhuǎn)化為親水性草氨醛,即NI的單線態(tài)氧響應(yīng)性。應(yīng)用激光照射引發(fā)Ce6產(chǎn)生單線態(tài)氧,包載Ce6的單線態(tài)氧響應(yīng)膠束(RM/Ce6)的水力學(xué)直徑隨著光照時(shí)間或單線態(tài)氧濃度的增加而增加;在無光照條件下,RM/Ce6的水力學(xué)粒徑保持不變。在光照的時(shí)間范圍內(nèi)(50分鐘),沒有出現(xiàn)粒徑曲線的平臺期。這間接表明NI在實(shí)驗(yàn)條件下未被完全氧化。透射電子顯微鏡的粒徑分析與水力學(xué)粒徑相一致。用激光照射50分鐘(660 nm,100mW/cm ~2)后,從透射電子顯微鏡圖片中可以看出,RM膠束從112±17 nm(多分散指數(shù)/PDI:0.15)增大至401±72 nm(PDI:0.18)。膠束的大小通常是由聚合物鏈長度、微結(jié)構(gòu)和兩親性的相互作用決定的。含有NI的聚合物膠束的尺寸增大原因是由于單線態(tài)氧誘導(dǎo)的疏水性NI轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性草酰醛。這種轉(zhuǎn)換導(dǎo)致聚合物分子兩親性的改變以及膠束的崩解。從粒度的變化趨勢來看,光敏劑Ce6在50分鐘的激光照射后產(chǎn)生大量的單線態(tài)氧,因此引起顯著的膠束膨脹。不過,由于在反應(yīng)終產(chǎn)物中存在多個(gè)供氫體和受體,理論上能夠形成三維氫鍵網(wǎng)絡(luò),因此未觀察到膠束的徹底崩解。這與在含有咪唑的膠束的單線態(tài)氧引起的尺寸擴(kuò)大中觀察到的現(xiàn)象類似。由于粒徑增長,水分子更容易擴(kuò)散到膠束中從而促進(jìn)藥物的釋放。因此,在有無光照的情況下可以觀察到顯著的藥物釋放差異。本課題還利用小鼠乳腺癌細(xì)胞(4T1細(xì)胞)進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)來間接證明單線態(tài)氧誘導(dǎo)的硝基咪唑-醛轉(zhuǎn)化。選擇游離Ce6(陽性對照),非響應(yīng)性mPEG-PBLA膠束(CM/Ce6,陰性對照)和響應(yīng)性膠束(RM/Ce6)的三個(gè)樣品。用三種不同的照射條件(1分鐘,5分鐘,10分鐘)對以上樣品進(jìn)行處理。無論照射時(shí)間長短,細(xì)胞毒性的強(qiáng)弱均如下:Ce6RM/Ce6CM/Ce6。由于沒有釋放屏障,游離的Ce6表現(xiàn)出最高的細(xì)胞毒性,即最低的半數(shù)致死濃度。在激光照射后,膠束的疏水內(nèi)核中Ce6產(chǎn)生單線態(tài)氧與NI反應(yīng),誘導(dǎo)膠束分解并釋放藥物(Ce6)。與之形成鮮明對比的是,非響應(yīng)性對照膠束的藥物釋放僅可通過簡單擴(kuò)散,藥物釋放速率顯著慢于RM組。因此,CM/Ce6樣品顯示出到更高的細(xì)胞活力(即低毒性)。由于單線態(tài)氧是細(xì)胞毒性的來源,因此在沒有激光照射的情況下,所有樣品均沒有檢測出毒性。作為另一種陰性對照,沒有光敏劑的非響應(yīng)性膠束在有無光照的情況下都沒有表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,隨著照射持續(xù)時(shí)間的增長,納米載藥膠束可以產(chǎn)生時(shí)間依賴性的細(xì)胞毒性。綜上所述,本課題揭示了單線態(tài)氧和硝基咪唑相互作用機(jī)理,主要終產(chǎn)物為草酰醛�；谶@種機(jī)制,具有缺氧敏感性的硝基咪唑聚合物膠束還具有單線態(tài)氧敏感特性,并且通過光照誘導(dǎo)的硝基咪唑-醛轉(zhuǎn)化引起膠束的快速分解從而促進(jìn)藥物釋放。單線態(tài)氧響應(yīng)性膠束的崩解可以在激光照射后觸發(fā)光敏劑的快速釋放,因此可以很好地解決單線態(tài)半衰期短和擴(kuò)散距離有限的問題。這種發(fā)現(xiàn)可通過觸發(fā)按需藥物釋放,從而克服大多數(shù)實(shí)體瘤治療中缺氧異質(zhì)性導(dǎo)致的藥物釋放不均一、不可控問題,進(jìn)而增強(qiáng)體內(nèi)抗癌功效。本課題構(gòu)建的缺氧/單線態(tài)氧雙敏感納米膠束給藥系統(tǒng)還可用于共遞送細(xì)胞毒性藥物與光敏劑實(shí)現(xiàn)化療與光動力學(xué)療法的協(xié)同作用。
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R943

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本文編號：2701045