本文關(guān)鍵詞：阿司匹林抑制破骨細(xì)胞生成的分子機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞體內(nèi)的動態(tài)平衡,是維持骨的體內(nèi)平衡的最關(guān)鍵因素,它是由單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞相互融合而成并發(fā)揮其骨吸收功能。RANKL,是腫瘤壞死因子的家族的一員,也是關(guān)鍵的破骨細(xì)胞分化因子,它通過與細(xì)胞表面RANK的結(jié)合,刺激激活胞漿內(nèi)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)表達,進而激活相應(yīng)的下游信號因子如P38,C-JNK,ERK,NF-κB。通過這種復(fù)雜的激活反應(yīng),最后破骨前體細(xì)胞相互融合成為成熟的多核破骨細(xì)胞,發(fā)揮破骨功能,并表達標(biāo)志性的蛋白如TRAP,CTSK,CTR,MMP-9等。骨質(zhì)疏松癥被認(rèn)為是一種代謝性疾病,其特征是骨量的減少和骨折風(fēng)險的增加,是老齡化社會一個主要的公共健康問題。幾種抗骨質(zhì)疏松藥物如雙膦酸鹽類、降鈣素及雌激素等已被廣泛運用于臨床,但是,它們都具有其臨床療效的局限性和副作用。阿司匹林是一種常見廉價安全的藥物,它通常被用作有效的解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎藥。近年也發(fā)現(xiàn)其有抗血栓、抗大腸癌等功效。然而,它似乎還有更多的功效有待被發(fā)現(xiàn)。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查和本課題組進行的初步研究,證明了阿司匹林對去勢大鼠模型的骨密度有促進作用,這意味著阿司匹林具有防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的潛在臨床價值。但阿司匹林如何起到抗骨質(zhì)疏松作用的分子機制尚未清楚。目的:研究不同濃度阿司匹林對RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞系中破骨細(xì)胞的生成分化和活性影響,以及其對破骨細(xì)胞中NF-κB通道和MAPKs通道系列信號分子表達及其磷酸化活性的影響,探討阿司匹林對破骨細(xì)胞影響的分子機制,從而為阿司匹林創(chuàng)新應(yīng)用于防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供全新的理論依據(jù)。方法:RAW264.7細(xì)胞系進行常規(guī)傳代培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞生長融合達80%時即可用于實驗。②實驗分為6組:A組陰性對照組,即常規(guī)培養(yǎng)液中不含阿司匹林及RANKL;B組陽性對照組,即常規(guī)培養(yǎng)液中加入100ng/ml RANKL;C-F組為添加不同濃度的阿司匹林實驗組(C組0.25m M、D組0.5m M、E組1.0m M、F組1.5m M),且均含100ng/ml RANKL。③將104每孔的處于對數(shù)期RAW264.7細(xì)胞接種于96孔板中,與不同濃度阿司匹林組共培養(yǎng)24h,進行常規(guī)MTT檢測活細(xì)胞的相對數(shù)量。④將2×105每孔對數(shù)期RAW264.7細(xì)胞接種于24孔板的爬片上,常規(guī)培養(yǎng)18h后,加入各組培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)5天,對各組細(xì)胞進行抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-Resistant Acid Phosphatase,TRAP)染色,把含有3個或者3個以上細(xì)胞核的TRAP陽性細(xì)胞認(rèn)為是破骨細(xì)胞。在光學(xué)顯微鏡下任意選取3個區(qū)域,觀察爬片上破骨細(xì)胞,并計數(shù)。⑤將2×105對數(shù)期RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板上,常規(guī)培養(yǎng)18h后,加入各組培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)5天,通過Real Time PCR技術(shù)檢測破骨細(xì)胞標(biāo)志物基因TRAP,CTSK,MMP-9,CTR的m RNA表達水平。⑥將2×105對數(shù)期RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板上,常規(guī)培養(yǎng)18h后,加入各組培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)2h,通過Western blot法檢測破骨細(xì)胞中NF-κB通道三個關(guān)鍵信號分子蛋白IκB-α、p50、p65及其磷酸化分子p-IκB-α、p-p50、p-p65的蛋白表達水平,同時檢測MAPKs通道三個信號分子蛋白ERK、p38、JNK及其磷酸化分子p-ERK、p-P38、p-JNK的蛋白表達水平。⑦將2×105對數(shù)期RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板爬片上,常規(guī)培養(yǎng)18h后,加入各組培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)2h,通過免疫熒光的方法檢測爬片上細(xì)胞中NF-κB p65的核易位。結(jié)果:1)在本研究培養(yǎng)所用阿司匹林濃度范圍內(nèi),即0.25m M、0.5m M、1.0m M及1.5m M,各培養(yǎng)組細(xì)胞未見明顯細(xì)胞變性或死亡現(xiàn)象,MTT結(jié)果顯示各組吸光值基本一致,阿司匹林沒有表現(xiàn)出對RAW264.7細(xì)胞的任何的細(xì)胞毒性。2)B、C、D、E、F實驗組中在RANKL誘導(dǎo)后均可見體積較大含大量酒紅色嗜酸性顆粒的多核細(xì)胞即破骨細(xì)胞形成,但隨著加入干預(yù)的阿司匹林濃度的升高,其破骨細(xì)胞形成數(shù)量逐步減少,且呈劑量依賴形式。3)破骨細(xì)胞標(biāo)志物TRAP,CTSK,MMP-9及CTR的m RNA表達量在RANKL誘導(dǎo)后均有很大的上調(diào),但阿司匹林干預(yù)后其標(biāo)志物的表達有所減少,并隨著阿司匹林濃度的增加其標(biāo)志物的表達量逐步減少,呈劑量依賴形式。4)在RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中,阿司匹林明顯抑制IκB α的降解以及其磷酸化。此外,阿司匹林也同時可以顯著降低p50、p65的磷酸化,而其非磷酸化的蛋白表達水平無明顯變化。5)對于MAPKs通路分子,阿司匹林在RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中對非磷酸化的ERK,p38和JNK的蛋白表達量影響不大,但阿司匹林能顯著抑制磷酸化的p-ERK,p-P38和p-JNK的表達。6)與未經(jīng)RANKL處理的細(xì)胞相比,RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中P65從胞質(zhì)易位到細(xì)胞核中明顯,而1m M阿司匹林干預(yù)后,進入細(xì)胞核的NF-κB P65明顯減小。結(jié)論:阿司匹林可以抑制RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的破骨細(xì)胞生成。這可能與阿司匹林抑制NF-κB信號通路分子(P65、P50、IκB α)和MAPKs(P38、C-JNK和ERK)信號通道分子的磷酸化激活有關(guān),且這種抑制作用在一定范圍內(nèi)和阿司匹林濃度呈正相關(guān)。阿司匹林也同時可以抑制NF-κB P65的核易位從而抑制NF-κB活性。這些研究結(jié)果預(yù)示了阿司匹林是一個潛在的預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的有效藥物。
【關(guān)鍵詞】：阿司匹林 破骨細(xì)胞 NF-κB MAPKs 骨質(zhì)疏松
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-15
• 文獻回顧15-26
• 實驗一 阿司匹林對RAW264.7 破骨細(xì)胞生成及其標(biāo)志物基因表達的影響26-44
• 1 實驗材料26-27
• 1.1 實驗用細(xì)胞株26
• 1.2 實驗試劑26-27
• 1.3 實驗設(shè)備27
• 2 實驗方法27-36
• 2.1 RAW264.7 細(xì)胞系的培養(yǎng)傳代及凍存27-30
• 2.2 MTT法來檢測阿司匹林對RAW264.7 細(xì)胞的毒性30-32
• 2.3 TRAP染色32-34
• 2.4 熒光實時定量RT-PCR技術(shù)34-36
• 2.5 統(tǒng)計分析36
• 3 實驗結(jié)果36-42
• 3.1 阿司匹林對破骨細(xì)胞生成的影響36-39
• 3.2 阿司匹林對破骨細(xì)胞標(biāo)志物基因表達的影響39-42
• 4 討論42-44
• 實驗二 阿司匹林對破骨細(xì)胞系中NF-κB和MAPKs信號通道的影響44-56
• 1 實驗材料44-45
• 1.1 實驗用細(xì)胞株44
• 1.2 實驗試劑44-45
• 1.3 實驗設(shè)備45
• 2 實驗方法45-53
• 2.1 RAW264.7 細(xì)胞的培養(yǎng)45-46
• 2.2 Western Blot技術(shù)46-53
• 3 實驗結(jié)果53-55
• 3.1 阿司匹林對NF-κB活化的影響53
• 3.2 阿司匹林對MAPKs的影響53-55
• 4 討論55-56
• 實驗三 阿司匹林對破骨細(xì)胞系中P65核易位的影響56-61
• 1 實驗材料56-57
• 1.1 實驗用細(xì)胞株56
• 1.2 實驗試劑56
• 1.3 實驗設(shè)備56-57
• 2 實驗方法57-58
• 2.1 實驗分3組，分組如下57
• 2.2 基本原理57
• 2.3 RAW264.7 細(xì)胞的培養(yǎng)57-58
• 2.4 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色步驟58
• 3 實驗結(jié)果58-59
• 4 討論59-61
• 小結(jié)61-62
• 參考文獻62-70
• 個人簡歷和研究成果70-71
• 致謝71

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王建超;頡強;桑宏勛;陳志文;王軍;秦國良;馬義善;;阿司匹林對去勢大鼠腰椎骨密度及微觀結(jié)構(gòu)的影響[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2012年12期

  本文關(guān)鍵詞：阿司匹林抑制破骨細(xì)胞生成的分子機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：262149