本文關(guān)鍵詞：早期鼻咽癌基因甲基化譜構(gòu)建及其在早期診斷中的作用探討

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【摘要】：背景與目的 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一種極具特色的腫瘤,具有復(fù)雜的病因?qū)W及奇特的地理分布,是我國華南地區(qū)發(fā)病率最高的頭頸部惡性腫瘤。其預(yù)后與分期密切相關(guān),Ⅰ期患者與Ⅳ期患者的5年生存率相差甚遠(yuǎn),Ⅰ期5年生存率約為93%,Ⅳ期病人5年生存率仍僅為40%左右。因鼻咽部解剖結(jié)構(gòu)特殊性,鼻咽癌早期診斷相對困難,患者往往因臨床癥狀就診時(shí)已是中晚期,盡管目前放射治療的設(shè)備和技術(shù)有較大的發(fā)展和改進(jìn),同時(shí)也采用了與手術(shù)、化療相結(jié)合的綜合治療,但晚期患者的5年生存率仍未得到明顯提高,其與早期患者5年生存率的差距仍較大,而臨床實(shí)踐顯示鼻咽癌的早期(Ⅰ期占4.8%、Ⅱ期占25.2%)診斷率低于30%。因此在目前病因不明無法進(jìn)行一級預(yù)防的情況下,提高早期診斷率是提高生存率的關(guān)鍵因素之一,尋找更加特異和敏感的指標(biāo)來篩查、診斷早期鼻咽癌,成為臨床亟待解決的問題。 目前公認(rèn)鼻咽癌的發(fā)生是遺傳、環(huán)境及EB病毒相互作用的結(jié)果,其發(fā)生、發(fā)展乃至轉(zhuǎn)移等是一個(gè)多基因參與的過程；EB病毒VCAIg-A等指標(biāo)應(yīng)用于高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測,但其篩選率低、假陽性率高等特點(diǎn)使其不能很好的滿足臨床工作的要求,近年來針對NPC的表觀遺傳學(xué)研究顯示相關(guān)基因的沉默在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,主要表現(xiàn)在抑癌基因啟動區(qū)CpG島的高甲基化導(dǎo)致表達(dá)下調(diào)或失活,腫瘤抑制功能喪失,從而引發(fā)腫瘤；研究還發(fā)現(xiàn)此類基因異常甲基化的在腫瘤發(fā)生前即可出現(xiàn),如p16、MGMT在肺鱗狀細(xì)胞癌患者確診前35個(gè)月即可在患者唾液中檢測到其異常。事實(shí)上基因甲基化是一個(gè)十分復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制,基因啟動子甲基化等分子生物標(biāo)記物檢測正逐步應(yīng)用到腫瘤的早期診斷、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及預(yù)后上來,某些腫瘤在未惡變之前就已經(jīng)發(fā)生了甲基化的改變,且經(jīng)過代謝釋放出來；早期對疑似惡變的患者進(jìn)行基因甲基化的相關(guān)檢測,尋找早期癌甚至是癌前病變階段腫瘤的甲基化改變,并給予適當(dāng)?shù)奶幚?很有可能在腫瘤的防治特別是在腫瘤的早期診斷方面發(fā)揮積極作用；因此深入研究明確甲基化改變與腫瘤發(fā)展的相關(guān)性,對腫瘤的早期診斷與篩查以及判斷腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、預(yù)后等方面有深遠(yuǎn)意義。而研究顯示基因甲基化在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中是常發(fā)事件,啟動子區(qū)DNA過甲基化是腫瘤發(fā)展早期的一種常見表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象,可引起相關(guān)的基因沉默。因此對DNA過甲基化的測定可作為早期診斷鼻咽癌的一種標(biāo)志,如能確定導(dǎo)致鼻咽癌或在鼻咽癌早期階段出現(xiàn)的異常甲基化基因,對無明顯癥狀鼻咽癌或預(yù)測鼻咽癌發(fā)生具有重要意義,可提高鼻咽癌的早診率從而提高鼻咽癌患者的5年生存率。 以往由于基因甲基化檢測標(biāo)本分別是細(xì)胞系、荷瘤或各個(gè)臨床分期混雜一起的臨床標(biāo)本,不能證明甲基化基因的發(fā)生時(shí)機(jī),無法確定特定基因甲基化是否為鼻咽癌早期階段的常發(fā)事件。同時(shí)由于臨床上鼻咽癌的早期(Ⅰ、Ⅱ期)診斷率低于30%,早期鼻咽癌標(biāo)本難以獲得,特別是Ⅰ期鼻咽癌患者標(biāo)本更為困難,因此如何通過基因檢測的方法驗(yàn)證早期鼻咽癌患者中基因甲基化狀況是目前研究熱點(diǎn),越來越多的研究開始關(guān)注高通量測序篩選鼻咽癌甲基化基因,譬如全基因組甲基化芯片的應(yīng)用,致力于建立一個(gè)完整覆蓋面廣的甲基化譜,從而作為NPC早期診斷、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等的分子生物指標(biāo)。 第一章Ⅰ期鼻咽癌DNA甲基化譜構(gòu)建 目的 本研究采用最新的甲基化DNA免疫共沉淀結(jié)合NimbleGen Human DNA Methylation3×720K CpG Island Plus RefSeq Promoter Array對早期鼻咽癌石蠟標(biāo)本進(jìn)行高通量測序分析,篩選出甲基化基因,初步構(gòu)建出早期鼻咽癌基因甲基化譜。 方法 收集4對Ⅰ期鼻咽癌石蠟標(biāo)本及正常對照鼻咽組織,分別提取DNA后質(zhì)檢合格；富集兩組樣品基因組甲基片段后采用NimbleGen Human DNA Methylation3×720K CpG Island Plus RefSeq Promoter Array對2組標(biāo)本進(jìn)行高通量測序分析,對雜交信號進(jìn)行掃描及初步數(shù)據(jù)處理,分析早期鼻咽癌癌與配對正常鼻咽粘膜組織的基因組DNA甲基化差異,最終篩選出兩組間差異甲基化譜。 結(jié)果 通過甲基化芯片初步篩選,鼻咽癌石蠟標(biāo)本中在全部4例標(biāo)本中均出現(xiàn)甲基化的數(shù)目是1242個(gè),而在正常對照鼻咽組織C1-C4中均出現(xiàn)甲基化的數(shù)目是2260個(gè)。同時(shí)篩選出早期鼻咽癌與正常鼻咽組織間差異表達(dá)甲基化基因249個(gè),篩選基因位于不同的染色體上,其中定位在19號染色體上的甲基化差異基因最多,其基因數(shù)達(dá)到34個(gè),占所有篩選出甲基化差異基因的比例為13.65%；另外定位在1、2、11、16、17號染色體上的甲基化差異基因數(shù)目也比較多,分布均在10個(gè)以上;而定位到4號、8號及21號染色體上的甲基化差異基因最少,分別只有2個(gè),所占的比例只有0.80%。 結(jié)論 本研究初步構(gòu)建了早期鼻咽癌的基因甲基化譜,獲得了兩組間差異化甲基化基因,為進(jìn)一步建立更為精確的鼻咽癌甲基化譜奠定了基礎(chǔ),同時(shí)差異化甲基化基因也為尋找新的鼻咽癌分子標(biāo)志物提供了可能。 第二章部分甲基化芯片結(jié)果的初步驗(yàn)證 目的 旨在通過甲基化特異性PCR (MSPCR)對基因芯片篩選的部分甲基化差異基因進(jìn)行驗(yàn)證,探討基因甲基化在鼻咽癌早期診斷與發(fā)展中的作用,進(jìn)一步尋找鼻咽癌早期腫瘤分子標(biāo)志物,最終提高鼻咽癌早期診斷并改善其臨床療效。 方法 收集35例確診的Ⅰ期鼻咽癌患者標(biāo)本信息,病理科切取石蠟切片,檢索文獻(xiàn)同時(shí)從龐大的基因芯片數(shù)據(jù)中篩選出RASSF1A、DAPK、CHFR、CDH1、 CDH13、WIF1、RIZ1、PGP9.5、KIF1A、IQCG、LMLN、P16、MGMT、EBNA-1、 LMP-1、DLEC、EGOT、SNORD66等18個(gè)差異甲基化基因,通過MSPCR方法檢測上述18個(gè)基因在35例早期鼻咽癌中甲基化情況。同時(shí)通過條件摸索建立多重MSP方法(multiplex-MSP),嘗試實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因甲基化表達(dá)譜的快速高通量檢測；具體我們對退火溫度相近而擴(kuò)增片段大小不同的基因進(jìn)行多重MSP嘗試。 結(jié)果 35例Ⅰ期鼻咽癌標(biāo)本中甲基化程度最高的是KIF1A、CDH13,全部標(biāo)本都發(fā)生甲基化,甲基化率100%,其中CDH13全部為不完全甲基化,而KIF1A則為全是完全甲基化；甲基化程度最低的是IQCG,全部標(biāo)本中均未發(fā)現(xiàn)甲基化情況,甲基化率為0；而甲基化率超過50%以上的基因有10個(gè),其分別是DAPK(54.30%)、RIZ1(57.10%)、EBNA-1(60.00%)、WIF1(62.90%)、SNORD66(68.60%)、PGP9.5(71.40%)、DLEC (74.30%)、 RSSF1A (74.30%)、CDH1(80.00%)、LMP-1(97.10%)、CDH13(100.00%)、KIF1A (100.00%)。 MMSPCR擴(kuò)增均得到理想結(jié)果,與預(yù)期相符。 結(jié)論 MSPCR驗(yàn)證結(jié)果與甲基化芯片掃描結(jié)果具有相似性,初步證實(shí)芯片結(jié)果的可靠性；MMSPCR擴(kuò)增均得到理想結(jié)果,與預(yù)期相符。
【關(guān)鍵詞】：早期鼻咽癌 甲基化芯片 甲基化譜 特異性PCR
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.63
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 前言14-27
• 參考文獻(xiàn)22-27
• 第一章 甲基化芯片檢測Ⅰ期鼻咽癌DNA甲基化分布27-59
• 一、材料27-29
• 二、方法29-35
• 三、結(jié)果35-59
• 第二章 甲基化芯片部分結(jié)果的驗(yàn)證59-79
• 一、材料59-66
• 二、方法66-71
• 三、結(jié)果71-79
• 討論79-86
• 結(jié)論86-87
• 參考文獻(xiàn)87-89
• 附錄圖89-98
• 中英文縮略詞對照表98-99
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果99-100
• 致謝100-101

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 洪明晃,閔華慶,郭翔,馬駿,麥海強(qiáng),張萬團(tuán),張峰,張錦明;從鼻咽癌分層綜合治療的結(jié)果來驗(yàn)證'92分期的合理性[J];癌癥;2000年05期

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3 項(xiàng)一寧,張維元;鼻咽癌組織中p16基因的缺失、高甲基化和蛋白的表達(dá)及其臨床意義[J];中華病理學(xué)雜志;2005年06期

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本文編號：611217