實(shí)驗(yàn)?zāi)康?順鉑是臨床廣泛使用的抗癌藥,但也可能會(huì)帶來(lái)諸多副作用,如耳毒性,多表現(xiàn)為感音神經(jīng)性耳聾和前庭功能障礙。研究其致聾機(jī)制和篩選相應(yīng)的保護(hù)藥物意義重大,而且對(duì)其他一些致聾藥物的治療也有借鑒作用。RNA轉(zhuǎn)錄后修飾是最近幾年表觀遺傳學(xué)研究熱點(diǎn)之一,6-甲基腺苷(m6A)是RNA最豐富的修飾形式,由m6A甲基轉(zhuǎn)移酶、m6A去甲基酶和結(jié)合蛋白三者來(lái)實(shí)施m6A水平的動(dòng)態(tài)調(diào)控。業(yè)已有研究證明,RNA去甲基化酶FTO(脂肪和肥胖相關(guān)酶蛋白)的高選擇抑制劑甲氯滅酸(MA)具有提高細(xì)胞內(nèi)m6A水平的作用。本研究利用順鉑誘導(dǎo)的耳蝸毛細(xì)胞系HEI-OC1細(xì)胞損傷模型,探討RNA去甲基化酶FTO的高選擇抑制劑甲氯滅酸乙酯衍生物(MA2)是否對(duì)順鉑引起的毛細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用以及具體保護(hù)機(jī)制,以期找到新的耳毒性藥物的保護(hù)藥,為耳聾治療提供新的思路。實(shí)驗(yàn)方法:1、首先將順鉑加入HEI-OC1細(xì)胞培養(yǎng)液建立毛細(xì)胞體外損傷模型,利用CCK-8檢測(cè)加藥后HEI-OC1細(xì)胞的相對(duì)存活率和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡(Annexin V-FITC/PI雙染法)的方法,選擇最合適的順鉑作用濃度和作用時(shí)間。接下去我們通過(guò)CCK-8確定MA2的最佳保護(hù)濃度,進(jìn)而了解MA2對(duì)順鉑損傷的保護(hù)作用,再通過(guò)Westemblot分析Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)和流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)MA2對(duì)順鉑引起的HEI-OC1細(xì)胞凋亡的保護(hù)效應(yīng)。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定各分組的藥物作用方式:對(duì)照組(DMSO組),MA2組,順鉑組,順鉑+MA2組,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用統(tǒng)一的作用方式。2、為了解細(xì)胞線粒體活性氧水平變化情況,我們用CelIROX(?)Deep Red偵查細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng),再使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。為排除其他因素干擾,將H202和順鉑分入8組(對(duì)照組、順鉑組、H202組、H202+順鉑組、MA2組、順鉑+MA2組、H202+MA2組、H202+順鉑+MA2組)以多種方式作用于HEI-OC1細(xì)胞,了解相應(yīng)處理后的活性氧水平變化;進(jìn)一步地,我們用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況(AnnexinV-FITC/PI雙染法),分析MA2對(duì)H202和順鉑引起的HEI-OC1細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用,從而明確MA2究竟是否通過(guò)抑制活性氧產(chǎn)生而達(dá)到減少細(xì)胞凋亡的機(jī)制。3、我們通過(guò)透射電鏡分別觀察在順鉑作用HEI-OC1細(xì)胞0、24、48小時(shí)后形態(tài)變化,包括胞膜、線粒體、核仁改變以及自噬溶酶體產(chǎn)生等情況,以圖在微觀層面揭示順鉑損傷后自噬現(xiàn)象的發(fā)生情況。通過(guò)Westernblot分析以及免疫熒光染色等多種方式,了解自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)情況以及MA2是否參與了對(duì)HEI-OC1細(xì)胞順鉑損傷后自噬的調(diào)控。為進(jìn)一步明確自噬在MA2對(duì)順鉑損傷后HEI-OC1細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)中的作用,我們利用公認(rèn)的自噬抑制劑LY294002和順鉑進(jìn)行分組研究,通過(guò)Westemblot分析了解LC3-Ⅱ蛋白和Cleaved-Caspase3蛋白的表達(dá)情況,從而明確MA2是否通過(guò)抑制過(guò)度自噬來(lái)減少細(xì)胞凋亡。4、為進(jìn)一步了解RNA表觀遺傳調(diào)控的作用,我們分別了解HEI-OC1細(xì)胞順鉑損傷后0、3、6、12、24、48小時(shí)后m6A的變化,以及MA2是否通過(guò)降低m6A水平來(lái)減少細(xì)胞凋亡。我們提取相應(yīng)樣本的總RNA,再用Dynabeads(?)mRNA純化試劑盒提取mRNA,經(jīng)安捷倫2100生物分析儀測(cè)定合格后,再通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè)定m6A與A的比值,從而驗(yàn)證MA2的FTO去甲基化酶抑制劑功能在順鉑誘導(dǎo)HEI-OC1細(xì)胞損傷過(guò)程中的作用是否得到發(fā)揮。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1、通過(guò) CCK-8 分析,0 μM、5 μM、10 μM、15 μM、20 μM、30 μM、40μM濃度的順鉑分別損傷HEI-OC1細(xì)胞48小時(shí)后,細(xì)胞相對(duì)存活率分別是100%、70.3 ±2.69%、56.79 ±2.97%、41.21 ±4.71%、20.72 ±3.67%、7.14 ±1.48%、5.88±1.42%。我們?cè)龠x取15 μM濃度的順鉑作用HEI-OC1細(xì)胞0、3、6、12、24、48小時(shí),通過(guò)流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)(AnnexinV-FITC/PI雙染法),凋亡細(xì)胞比值分別為 5.29 ± 0.77%、6.55 ± 0.65%、7.85 ± 0.52%、10.13 ± 0.65%、20.1 ± 0.43%、27.47 ± 0.5%。因此,我們選擇15μM順鉑作用48小時(shí)建立HEI-OC1細(xì)胞損傷模型。2、根據(jù)文獻(xiàn)提供的濃度區(qū)間,我們選擇0 μM、70μM、80μM、90μM的MA2分別作用HEI-OC1細(xì)胞48小時(shí),CCK-8報(bào)告細(xì)胞相對(duì)存活率分別是100%、104.26 ±9.33%、95.22 ±5.67%、81.73 ±7.08%,因此我們選擇 80μM 做為 MA2的工作濃度(與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異)。為明確80μMMA2對(duì)15 μM順鉑作用HEI-OC1細(xì)胞48小時(shí)的保護(hù)效應(yīng),我們通過(guò)CCK-8檢測(cè)對(duì)照組(DMSO組)、MA2組、順鉑組以及順鉑+MA2組的細(xì)胞相對(duì)存活率,分別是100%、95.13±2.20%、43.67 ± 4.74%、78.66 ± 8.89%,順鉑組和順鉑+MA2組差異肴統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示MA2有很好的保護(hù)作用。3、Cleaved-Caspase3是蛋白酶Caspase3的活化形式,提示細(xì)胞凋亡,Westernblot分析發(fā)現(xiàn)在順鉑分別損傷HEI-OC1細(xì)胞0、3、6、12、24、48小時(shí)后,Cleaved-Caspase3的表達(dá)逐漸增多,在48小時(shí)達(dá)到峰值。進(jìn)一步的MA2的保護(hù)研究,Western blot分析發(fā)現(xiàn)順鉑+MA2組相對(duì)順鉑組,Cleaved-Caspase3表達(dá)明顯下降,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示MA2抑制了順鉑引起的HEI-OC1細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)顯示,順鉑組凋亡細(xì)胞比值明顯上升(29.05±9.50%,對(duì)照組為4.44 ±1.68%),而順鉑+MA2組則明顯下降(17.51 ±0.81%),兩者差異有顯著性,同樣提示MA2顯著減少了順鉑引起的HEI-OC1細(xì)胞凋亡。4、活性氧和耳毒性藥物引起的毛細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行活性氧檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn),無(wú)論是順鉑、H202還是順鉑+H202(活性氧水平上升分別是2.16±0.07倍、2.01±0.18倍、4.73±1.21倍),MA2都可以顯著降低活性氧水平(順鉑+MA2、H202+MA2、順鉑+H202+MA2 分別是 1.45±0.07 倍、1.37±0.1倍、1.77±0.16倍),前后分別比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣,我們通過(guò)CCK-8檢測(cè),順鉑+MA2組的細(xì)胞相對(duì)存活率相比順鉑+H202+MA2組明顯提高(80.54 ± 3.44%比59.22 ± 2.29%),通過(guò)流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè),順鉑+MA2組的凋亡細(xì)胞比值相比順鉑+H202+MA2組明顯降低(17.56± 0.49%比24.7 ± 1.4%),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果證明MA2通過(guò)抑制了細(xì)胞內(nèi)的活性氧產(chǎn)生而減少了順鉑引起的HEI-OC1細(xì)胞凋亡。5、自噬是細(xì)胞正常的生理現(xiàn)象,但過(guò)量自噬會(huì)引起細(xì)胞死亡和相應(yīng)病理變化。我們通過(guò)透射電鏡觀察了順鉑作用0、24、48小時(shí)后HEI-OC1細(xì)胞的自噬水平的變化。正常細(xì)胞質(zhì)膜完整,微絨毛清晰,線粒體形態(tài)呈橢圓形或圓形,基本未見空化,細(xì)胞核呈圓形,核內(nèi)可見核仁,以常染色質(zhì)為主;順鉑作用24小時(shí)以后,大部分細(xì)胞質(zhì)膜尚完整,可見微絨毛,線粒體基本正常,可見少許線粒體空化,細(xì)胞漿內(nèi)可見少量自噬溶酶體,細(xì)胞核異型性明顯;作用48小時(shí)以后,凋亡細(xì)胞明顯增多,周圍可見菊花小體,細(xì)胞漿內(nèi)可見大量自噬溶酶體,細(xì)胞核核質(zhì)濃縮,電子密度升高,異染色質(zhì)邊集。LC3-Ⅱ是反映細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量的經(jīng)典指標(biāo),通過(guò)Westernblot分析順鉑分別損傷HEI-OC1細(xì)胞0、3、6、12、24、48小時(shí)后LC3-Ⅱ表達(dá)變化,我們發(fā)現(xiàn)LC3-Ⅱ表達(dá)水平逐漸上升,在48小時(shí)達(dá)到峰值。以上這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都提示順鉑損傷HEI-OC1細(xì)胞后自噬明顯增多,過(guò)量自噬可能導(dǎo)致了細(xì)胞的凋亡。6、為了解MA2在順鉑損傷HEI-OC1細(xì)胞后自噬調(diào)控中的作用,首先實(shí)施了免疫熒光染色。我們發(fā)現(xiàn)順鉑組細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)了大量自噬體形成,LC3-Ⅱ強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),而在順鉑+MA2組,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)了 LC3-Ⅱ表達(dá)下降,提示自噬體形成明顯減少。其次,Westemblot分析也證實(shí),相比順鉑組,順鉑+MA2組的LC3-Ⅱ表達(dá)明顯下降。兩者都提示MA2抑制了過(guò)度自噬。LY294002可以抑制PI3K/Akt信號(hào)途徑,是公認(rèn)的自噬抑制劑。通過(guò)Westemblot分析,我們發(fā)現(xiàn)不管是10μM還是20μM的LY294002,都可以抑制順鉑誘導(dǎo)的自噬增加表現(xiàn)為L(zhǎng)C3-Ⅱ表達(dá)明顯下降,同時(shí)還伴有Cleaved-caspase3表達(dá)下降。以上結(jié)果提示通過(guò)抑制自噬可以達(dá)到減少凋亡的目的,因此,MA2很可能通過(guò)參與了對(duì)順鉑引起的過(guò)量自噬的抑制,繼而減少了細(xì)胞凋亡。7、我們多步驟提取的樣本mRNA首先經(jīng)NanoDrop濃度測(cè)定和安捷倫2100生物分析儀分析,無(wú)論是純度還是質(zhì)量都符合實(shí)驗(yàn)要求。我們?cè)偻ㄟ^(guò)LC-MS/MS測(cè)定m6A與A的比值。我們首先發(fā)現(xiàn)在順鉑分別作用HEI-OC1細(xì)胞0、3、6、12、24、48小時(shí)后,細(xì)胞內(nèi)的m6A水平并沒有呈現(xiàn)有規(guī)律的變化,各時(shí)間點(diǎn)的m6A與A的比值差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,另一方面,各處理組(對(duì)照組、MA2組、順鉑組、順鉑組+MA2組)的m6A與A的比值也沒有顯著性差異。以上結(jié)果提示本研究采取的順鉑損傷HEI-OC1細(xì)胞的作用方式以及MA2的保護(hù)作用沒有直接與m6A表觀調(diào)控相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:甲氯滅酸通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)活性氧積累以及抑制過(guò)度自噬產(chǎn)生從而減少順鉑誘導(dǎo)的耳蝸毛細(xì)胞系HEI-OC1細(xì)胞凋亡。甲氯滅酸對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與其本身RNA去甲基化酶抑制劑的功能不直接相關(guān)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R764.43
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實(shí)驗(yàn)結(jié)果
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本文編號(hào)：2891707