發(fā)布時間：2020-11-19 12:50

　　 視神經疾病等神經性慢性致盲性眼病,目前尚無有效的治療方法,藥物治療仍是這些疾病的主要治療手段之一。神經營養(yǎng)因子對視網膜神經細胞的保護作用的研究一直是眼科屆研究的重點,由于眼球結構的特殊性,視網膜給藥苦難重重,如何才能達到安全、持久、有效的視網膜給藥治療效果仍然是有待克服的難題。 近些年來,眼內蛋白緩釋給藥系統(tǒng)的開發(fā)和應用從一定程度上克服了傳統(tǒng)給藥方式(如全身給藥、滴眼、局部注射等)藥物難以到達眼內或難以達到持久、安全的藥效的不足。 研究證明,促紅細胞生成素(Erythropoietin, EPO)對視網膜神經節(jié)細胞、感光細胞、視網膜色素上皮細胞等均具有神經保護作用,且價格相對便宜,具有很好的臨床應用前景。本研究就乳酸/羥基乙酸共聚物[Poly(L-lactic-co-glycolic acid), PLGA]包裹的EPO緩釋微球注射到SD大鼠視神經挫傷模型的玻璃體腔來探討這種緩釋系統(tǒng)對視網膜神經細胞保護作用的可行性及長效的視網膜神經保護作用。 第一部分促紅細胞生成素緩釋微球的制備和體外釋放實驗 目的制備裝載EPO的PLGA緩釋微球(EPO-PLGA微球),并探討其體外EPO釋放曲線。 方法利用低溫誘導相分離方法制備EPO多糖微粒,然后用水包油-油包固法(Solid-in-oil-in-water method, S/O/W法)制備EPO-PLGA緩釋微球。ELISA法檢測所制備的EPO-PLGA緩釋微球EPO的釋放曲線。 結果S/O/W法制備的EPO-PLGA緩釋微球,表面光滑,粒徑在40-100μm之間,體外釋放第一天突釋小于10%,緩釋到第60天時,釋放率可達80%以上,釋放持久穩(wěn)定,釋放曲線接近線性釋放。 結論S/O/W法制備的EPO-PLGA緩釋微球可以達到EPO的長效線性緩釋作用,為進一步探討EPO-PLGA緩釋微球的生物學藥效提供了依據。 第二部分促紅細胞生成素緩釋微球體外活性和安全性的評估 目的探討EPO-PLGA緩釋微球的體外活性,并對PLGA及其降解產物安全性進行評估。 方法建立體外培養(yǎng)的大鼠視網膜組織三維立體培養(yǎng)系統(tǒng),取1—3天新生SD大鼠視網膜,選取旁中心區(qū)視網膜,切成0.5mm×0.5mm大小植片,培養(yǎng)其中,分四組：EPO組,EPO-PLGA組,PLGA組和對照組,分別加入EPO (1 IU/mL)、EPO-PLGA釋放液(含EPO 1 IU/mL)、空白PLGA釋放液,對照組不加。在倒置相差顯微鏡下動態(tài)觀察視網膜神經節(jié)細胞軸突生長情況,取培養(yǎng)第6天進行統(tǒng)計分析。 結果培養(yǎng)第6天后,從視網膜植片軸突再生的平均長度和密度來看,與對照組相比,EPO和EPO-PLGA釋放液對視網膜神經節(jié)細胞軸突生長均有促進作用,具有顯著統(tǒng)計學差異(p0.001)；而空白PLGA釋放液組與對照組間無明顯差別(p0.05)。 結論EPO-PLGA緩釋微球在制備和釋放過程中不影響EPO的生物學活性,且PLGA及其降解產物無明顯的組織細胞毒副作用。 第三部分促紅細胞生成素緩釋微球對視神經挫傷大鼠視網膜神經節(jié)細胞-長效保護作用的實驗研究 目的以視神經挫傷大鼠為模型,探討促紅細胞生成素緩釋微球EPO-PLGA微球經玻璃體腔注射對受損視網膜神經節(jié)細胞的長效保護作用。 方法選取成年SD大鼠,分為五組：未治療組,EPO組,EPO-PLGA組,PBS組和PLGA組。建立視神經挫傷模型。建模后,未治療組不予玻璃體腔注射,EPO組分別于即刻和造模后4周玻璃體腔內注射EPO10IU (5μL), EPO-PLGA組即刻給予玻璃體腔內注射EPO-PLGA緩釋微球20mg (5μL,含EPO 20 IU), PBS組分別于即刻和造模后4周給予玻璃體腔內注射0.01M PBS (5μL), PLGA組即刻給予玻璃體腔內注射空白PLGA微球20mg(5μL)。分別術后4周和8周處死大鼠,處死前5天DiI上丘逆標視網膜神經節(jié)細胞(Reinal Ganglion Cells, RGCs),視網膜鋪片觀察各組RGCs存活情況；視網膜切片TUNEL檢測各組分別在術后1天、5天、2周、4周RGCs的凋亡情況；免疫組化檢測各組分別在術后1天、5天、2周、4周視網膜神經膠質原纖維酸性蛋白(Glial Fibrilary Acid Protein, GFAP)的表達情況。 結果視網膜鋪片RGCs計數(shù)顯示,正常SD大鼠RGCs密度為2387.69±164.87(個/mm2)；術后4周,未治療組、EPO組、EPO-PLGA組、PBS組和PLGA組RGCs密度(個/mm2)分別為748.30±58.81、1418.52±154.91、1296.68±157.55、804.43±86.44和821.72±52.13；術后8周,未治療組、EPO組、EPO-PLGA組、PBS組和PLGA組RGCs密度(個/mm2)分別為532.74±35.14、1083.66±57.82、913.98±37.72、548.01±47.00和561.96±34.23；EPO組和EPO-PLGA組較未治療組具有明顯的RGCs保護作用,統(tǒng)計學意義顯著(P0.001),而EPO組和EPO-PLGA組間無明顯差異(P0.05)。視網膜切片TUNEL檢測顯示,術后1天、5天、2周、4周各組視網膜節(jié)細胞層均可見TUNEL陽性細胞，其中在術后1天、5天,EPO組和EPO-PLGA組TUNEL陽性細胞率顯著少于未治療組、PBS組及PLGA組,具有顯著的統(tǒng)計學意義(p0.001),術后2周、4周后,各組間視網膜節(jié)細胞層的TUNEL陽性率差異不明顯,差別無統(tǒng)計學意義(p0.05)；而節(jié)細胞層DAPI染色顯示,術后5天、2周、4周各組視網膜節(jié)細胞層的細胞數(shù)EPO組和EPO-PLGA組均顯著多于未治療組、PBS組及PLGA組,具有統(tǒng)計學意義(p0.01)。視網膜切片GFAP免疫組化顯示,術后5天、2周、4周,EPO和EPO-PLGA兩組中視網膜GFAP的表達量均顯著低于未治療組、PBS組及PLGA組,差別無統(tǒng)計學意義(p0.05)。 結論EPO-PLGA緩釋微球單次玻璃體腔注射能長效保護大鼠視神經挫傷引起的視網膜神經節(jié)細胞的損傷和丟失,效果等同于定期重復多次EPO玻璃體腔注射。
【學位單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2010
【中圖分類】：R774.1
【部分圖文】：

1EPO一PLGA微球形態(tài)5/0/w方法制備的EPO緩釋微球，表面光滑，粒徑在40一100林m之間，如圖所示(圖1)。圖1光學顯微鏡下EPO一PLGA緩釋微球形態(tài)外觀可見微球形狀圓，表面光滑，直徑在40一100林m之間 2EPO一PLGA緩釋微球體外釋放曲線 2.1EPO標準曲線EPO蛋白ELISA標準曲線如下圖(圖2)

2.2EPO一PLGA體外釋放曲線EPO多糖顆粒進一步通過5/0/W制備方法包裹于PLGA微球中，所得EPO一PLGA緩釋微球第一天突釋小于10%，第60天釋放率達到80%以上，釋放持久、穩(wěn)定。其體外釋放曲線如圖所示(圖3)。n”︶n”n”O(jiān)QOnUnU八︸‘U泊，，自l心.衛(wèi)歲。s戈。一。J。A一祠.一Iunn口

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【參考文獻】

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2 貢亦清;陳逖;石春和;殷孝健;周敏;陳永東;;氟尿嘧啶脂質體玻璃體注射防治增生性玻璃體視網膜病變的實驗研究[J];眼外傷職業(yè)眼病雜志(附眼科手術);2008年02期

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本文編號：2890031