背景:鼻咽癌是我國南方常見的惡性腫瘤之一,早期患者容易發(fā)生淋巴結轉移,腫瘤微環(huán)境中細胞與細胞的交互作用可能對淋巴結轉移起到了極其重要的作用。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn),鼻咽癌高淋巴結轉移細胞株5-8F條件培養(yǎng)基(conditioned medium,CM)明顯促進淋巴管內(nèi)皮細胞(lymphatic endothelial cell,LEC)的增殖,而LEC細胞條件培養(yǎng)基促使5-8F細胞的侵襲遷移能力增強;通過兩種細胞的共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)可以明顯促進細胞的運動和遷移,特別是直接接觸培養(yǎng)尤為明顯。接著,我們通過分選型流式細胞儀將共培養(yǎng)后的兩種細胞分選出來分別與單獨培養(yǎng)的同種細胞進行RNA-Seq及蛋白抗體芯片檢測,并通過生物信息學分析篩選了潛在的作用通路。根據(jù)分析結果,發(fā)現(xiàn)差異分子主要富集于TGF-β信號通路以及細胞粘附、細胞趨化因子、血管生成因子等方面,并且共培養(yǎng)后細胞內(nèi)的miR-17-92等部分miRNA存在表達差異。目的:反復驗證體外共培養(yǎng)條件下LEC與5-8F細胞的交互作用,同時驗證共培養(yǎng)后的差異表達分子,并綜合分析其在鼻咽癌轉移中的可能作用。方法:分別制備LEC與5-8F細胞培養(yǎng)24h后的條件培養(yǎng)基,將兩種細胞進行條件培養(yǎng)基共培養(yǎng),然后通過Realtime-PCR和Western Blot方法檢測細胞中TGF-β及部分轉移相關分子的表達情況;接著采用條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)和transwell共培養(yǎng)兩種方式進行LEC和5-8F的共培養(yǎng),分別檢測細胞以及上清液中miR-17-92基因簇成員的表達情況;最后對miR-17-92進行靶基因預測及生物信息學分析。結果:1.采用Realtime-PCR和Western Blot方法檢測CM共培養(yǎng)前后LEC和5-8F細胞中基因和蛋白的表達情況,發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后,LEC細胞中TGF-β以及轉移相關分子(CTGF、Fractalkine、DCN、IGF-2R、MIF)表達均降低了;而在5-8F細胞中表達均升高了。2.從轉錄水平和蛋白水平檢測E-cadherin的表達情況,發(fā)現(xiàn)CM共培養(yǎng)后LEC和5-8F細胞中表達均降低了,而β-catenin、MMP-9和Vimentin在轉錄水平的表達均升高了。3.CM共培養(yǎng)后,5-8F和LEC細胞以及上清液中的大多數(shù)miR-17-92基因簇成員的表達升高了。4.在transwell共培養(yǎng)中,當5-8F接種于下室,LEC接種于上室時,共培養(yǎng)后這兩種細胞以及上清液中miR-17-92基因簇成員的表達均明顯升高了;而當LEC接種于下室,5-8F接種于上室時,共培養(yǎng)后這兩種細胞中miR-17-92基因簇成員的表達也均明顯升高,但共培養(yǎng)后的上清液中miR-17-92基因簇的大多數(shù)成員表達降低了。5.GO分析發(fā)現(xiàn),miR-17-92的預測靶基因主要參與了細胞過程、生物調(diào)節(jié)、代謝過程、應激反應、發(fā)展過程、細胞成分組織或生物起源等生物過程;KEGG Pathway分析發(fā)現(xiàn),靶基因顯著富集于內(nèi)吞作用通路、MAPK信號通路、Wnt信號通路、癌癥中的蛋白聚糖通路、非小細胞肺癌通路、PI3K-Akt信號通路、黏附連接、凋亡、TGF-beta信號通路等。結論:1.條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)后,5-8F細胞中的TGF-β通路部分關鍵基因上調(diào),可能是其遷移能力增強的原因之一,而共培養(yǎng)后LEC細胞中的TGF-β通路部分關鍵基因表達下調(diào),可能促進了LEC的增殖。2.鼻咽癌細胞5-8F可刺激LEC細胞分泌miR-17-92,而miR-17-92基因簇的上調(diào)可能與淋巴管內(nèi)皮細胞增生相關。
【學位單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R739.63
【部分圖文】：

共培養(yǎng)后細胞中基因表達情況

2.2 條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)前后細胞中的蛋白表達檢測利用 Western Blot 方法檢測條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)前后細胞中的蛋白表達水平，結果如圖1-2所示，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后，與對照組相比LEC細胞中TGF-β1、TGF-β2（p<0.05）、CTGF、Fractalkine（p<0.05）、DCN、IGF-2R（p<0.05）、MIF、E-cadherin 表達均降低了；在 5-8F 細胞中 TGF-β1（p<0.05）、TGF-β2、CTGF、Fractalkine（p<0.05）、DCN、IGF-2R（p<0.05）、MIF 表達均升高了，而 E-cadherin 雖然表達有下降的趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學意義。WB結果均與 Realtime-PCR 結果 致。圖 1-2 共培養(yǎng)后細胞中蛋白表達情況Figure 1-2 The expression of protein in cells after co-cultured by western blot.3 討論鼻咽癌是我國南方常見的惡性腫瘤之 ，尤其是廣東和廣西等地發(fā)病率很高。大多數(shù)患者初診時就發(fā)現(xiàn)有淋巴結轉移，NPC 淋巴結轉移不但影響了治療計劃和臨床分期，同時也影響了患者的療效和預后。NPC 淋巴結轉移的分子機制目前還不是十分清楚，因此深入探討 NPC 淋巴結轉移規(guī)律

49圖 2-4 transwell 共培養(yǎng)后 LEC 細胞中 miRNA 表達情況Figure 2-4 Expression of miRNA in LEC cells after transwell co-culture. LEC_low, LEC is planted in thelower chamber; LEC_up, LEC is planted in the upper chamber.
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本文編號：2889239