背景:視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)是一種由于視網(wǎng)膜感光細(xì)胞受損而導(dǎo)致夜盲和進(jìn)行性視野缺損的遺傳性致盲眼底病。在單基因致盲性眼底病中,發(fā)病率居首位,是致盲的主要原因之一,在中國人群中發(fā)病率約為1/3500。RP尚無有效防治手段,迄今已鑒定出的70個(gè)致病基因,能解釋約60%~70%的病例,尚有約40%的病例有待發(fā)現(xiàn)致病基因。對象與方法:本文以三個(gè)常染色體顯性遺傳RP家系作為研究對象,應(yīng)用高通量測序技術(shù)進(jìn)行RP致病基因鑒定,并對候選致病基因進(jìn)行了初步的功能研究。主要研究內(nèi)容分兩部分:一、RP家系基因變異分析;二、候選致病基因的功能研究。研究方法包括:(1)對家系進(jìn)行全基因外顯子組測序,經(jīng)公共dbSNP數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫、Ex AC數(shù)據(jù)庫比對過濾掉普遍變異,獲得候選致病突變位點(diǎn),進(jìn)行家系驗(yàn)證。(2)構(gòu)建候選致病基因突變質(zhì)粒進(jìn)行體外細(xì)胞學(xué)功能研究:構(gòu)建ADAM15及PRPF31基因質(zhì)粒(包括野生型和突變型),進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,通過WB和ICC方法分析基因在細(xì)胞中的表達(dá)及定位。(3)對未能確認(rèn)遺傳病因的家系運(yùn)用芯片檢測進(jìn)行全基因組連鎖分析及全基因組低深度測序檢測CNV。結(jié)果:(1)在RP家系1的致病基因研究中,(1)對先證者RP1-1樣本進(jìn)行全外顯子組測序,在已知RP致病基因中篩選出5個(gè)候選致病突變位點(diǎn)。5個(gè)候選變異位點(diǎn)分別位于4個(gè)已知RP致病基因(ABCA4,TULP1,PRPF31,PRPH2);(2)Sanger測序家系驗(yàn)證結(jié)果顯示PRPF31基因c.855+5GA雜合突變符合基因型與表型共分離;(3)對先證者及家系正常表型個(gè)體外周血PRPF31基因mRNA進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增,RP1-1患者存在兩條大小分別為1.5kb及1.1kb的PCR產(chǎn)物條帶,正常表型對照僅見一條1.5kb的特異性PCR產(chǎn)物條帶。1.5kb條帶PCR產(chǎn)物測序結(jié)果為PRPF31基因(NM_015629)cDNA全長序列。1.1kb條帶測序結(jié)果顯示PRPF31基因(NM_015629)缺失了cDNA第996位至1406位中間共計(jì)409個(gè)核苷酸。該區(qū)域位于PRPF31基因外顯子第10、11、12、13及14區(qū)域。(4)在轉(zhuǎn)染了PRPF31-pEGFP-N1野生型質(zhì)粒的Cos7細(xì)胞中,PRPF31蛋白定位在Cos7細(xì)胞的細(xì)胞核;而轉(zhuǎn)染了PRPF31-pEGFP-N1突變型質(zhì)粒的Cos7細(xì)胞中,PRPF31蛋白表達(dá)量降低,主要分布于細(xì)胞漿中,細(xì)胞核僅有少量PRPF31蛋白。(2)在RP家系2的致病基因研究中,(1)通過全外顯子組測序及數(shù)據(jù)分析得到7個(gè)候選致病突變位點(diǎn);(2)Sanger測序家系驗(yàn)證結(jié)果顯示ADAM15基因c.713GA(p.R238H)雜合突變符合基因型與表型家系共分離,確定為候選致病基因。(3)與轉(zhuǎn)染野生型ADAM15基因表達(dá)質(zhì)粒的293T細(xì)胞比較,轉(zhuǎn)染ADAM15基因c.713GA(p.R238H)突變表達(dá)質(zhì)粒的293T細(xì)胞ADAM15蛋白表達(dá)量降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.0298)。(4)ICC實(shí)驗(yàn)顯示,ADAM15突變型蛋白與野生型蛋白在Cos7細(xì)胞中均顯示出在細(xì)胞膜、細(xì)胞漿及核膜周圍均勻分布。(3)在RP家系3致病基因研究中,(1)運(yùn)用全外顯子組測序及數(shù)據(jù)分析后獲得30個(gè)候選致病變異位點(diǎn)。(2)家系驗(yàn)證結(jié)果顯示共計(jì)有7個(gè)變異位點(diǎn)符合基因型與表型家系共分離,7個(gè)候選基因?yàn)?ENO4,FBXO18,NPBWR2,SLC7A11,UNC79,ZGPAT,LAMA5。(3)采用Humanomni中華芯片對家系共8個(gè)樣本進(jìn)行檢測,進(jìn)行多點(diǎn)參數(shù)連鎖分析。沒有檢測到LOD值大于2支持連鎖的相關(guān)區(qū)域。(4)低深度全基因組雙端測序檢測CNV方法對先證者RP3-1進(jìn)行CNV分析,共檢出194個(gè)CNV,大小范圍為4.5-35.6kb。得到13個(gè)可能具有致病性的CNV,11個(gè)CNV為拷貝數(shù)減少,2個(gè)CNV為拷貝數(shù)增加。結(jié)論:(1)PRPF31基因c.855+5GA雜合突變?yōu)镽P家系1致病突變。該突變?yōu)榧羟型蛔?影響PRPF31基因mRNA剪切;并且降低PRPF31蛋白表達(dá),影響PRPF31蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的定位。(2)ADAM15基因c.713GA(p.R238H)雜合突變?yōu)镽P家系2候選致病突變。該變異降低ADAM15蛋白表達(dá)量;但對ADAM15蛋白在細(xì)胞中的定位沒有影響。(3)在RP家系3發(fā)現(xiàn)位于ENO4,FBXO18,NPBWR2,SLC7A11,UNC79,ZGPAT,LAMA5共7個(gè)基因上的變異位點(diǎn)符合基因型與表型家系共分離。連鎖分析沒有檢測到LOD值大于2支持連鎖的相關(guān)區(qū)域。低深度全基因組雙端測序,檢出13個(gè)可能具有致病性的CNV。11個(gè)CNV為拷貝數(shù)減低,2個(gè)CNV為拷貝數(shù)增加。
【學(xué)位單位】：電子科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R774.13
【文章目錄】：
摘要
abstract
縮略詞表
第一章 緒論
    1.1 視網(wǎng)膜色素變性臨床特征
    1.2 視網(wǎng)膜色素變性基因研究現(xiàn)狀
    1.3 視網(wǎng)膜色素變性的遺傳異質(zhì)性和臨床異質(zhì)性
    1.4 高通量測序技術(shù)是視網(wǎng)膜色素變性研究和臨床基因診斷的有效手段
    1.5 本論文的主要貢獻(xiàn)與創(chuàng)新
    1.6 本論文的結(jié)構(gòu)安排
第二章 研究對象及實(shí)驗(yàn)方法
    2.1 研究對象
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑
        2.2.2 全基因外顯子組測序
        2.2.3 Humanmoni中華芯片檢測及連鎖分析
        2.2.4 低深度全基因組測序及CNV分析
        2.2.5 Sanger測序
        2.2.6 PRPF31-pEGFP-N1質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.7 ADAM15基因點(diǎn)突變
        2.2.8 細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、蛋白免疫印跡法、免疫細(xì)胞化學(xué)
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 RP家系1致病基因研究結(jié)果
        3.1.1 全外顯子組測序結(jié)果
        3.1.2 Sanger測序結(jié)果
A突變生物信息學(xué)分析'>        3.1.3 PRPF31基因c.855+5G>A突變生物信息學(xué)分析
        3.1.4 PRPF31基因體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.2 RP家系2致病基因研究結(jié)果
        3.2.1 全外顯子組測序結(jié)果
        3.2.2 Sanger測序結(jié)果
A（p.R238H）突變生物信息學(xué)分析'>        3.2.3 ADAM15基因c.713G>A（p.R238H）突變生物信息學(xué)分析
        3.2.4 ADAM15基因體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.3 RP家系3致病基因研究結(jié)果
        3.3.1 全外顯子組測序結(jié)果
        3.3.2 Sanger測序結(jié)果
        3.3.3 家系連鎖分析結(jié)果
        3.3.4 低深度全基因組雙端測序檢測CNV
    3.4 本章小結(jié)與討論
        3.4.1 RP家系1致病基因研究小結(jié)與討論
        3.4.2 RP家系2致病基因研究小結(jié)與討論
        3.4.3 RP家系3致病基因研究小結(jié)與討論
第四章 總結(jié)與展望
    4.1 本文工作總結(jié)
    4.4 后續(xù)工作展望
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間取得的成果

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;A COMPLETE SCREEN FOR MUTATIONS OF THE RHODOPSIN GENE IN A PANEL OF CHINESE PATIENTS WITH AUTOSOMAL DOMINANT RETINITIS PIGMENTOSA[J];Chinese Medical Sciences Journal;2005年01期

本文編號：2869609