研究背景 真菌性角膜炎(Fungal keratitis)是一種潛在的威脅視力的疾病,近年來在美國和中國的發(fā)病率急劇增加,因此需要及時準確的診斷和積極的治療,以防止視力下降。在美國和其他工業(yè)化國家,長期佩戴隱形眼鏡是真菌性角膜炎的首要原因；而在發(fā)展中國家,農(nóng)業(yè)勞動是主要的危險因素。近年來,隨著免疫抑制劑的廣泛使用,長期使用廣譜抗生素和艾滋病也被視為真菌性角膜炎的危險因素。真菌性角膜炎是感染性角膜病中最具挑戰(zhàn)性的疾病之一,近幾年,真菌性角膜炎發(fā)病率已上升到感染性角膜病的首位(占51%-70%),因此,真菌性角膜炎的防治研究已成為我國致盲性眼病的重大科學問題。真菌性角膜炎在熱帶、亞熱帶地區(qū)發(fā)病率高,有超過105種真菌可引起眼部感染,主要是鐮孢屬、彎孢屬、曲霉屬和念珠菌屬四大類,而在我們國家,真菌性角膜炎主要致病菌為鐮刀菌屬,約占感染病例的70%-80%,次之為曲霉菌屬,約占10%,念珠菌屬只占2%。因此,只有更好地理解角膜抗真菌感染的免疫防御分子機制才能更好地制定詳細的治療策略。 一般情況下,真菌不會侵犯正常角膜,但當角膜上皮破壞,角膜基質(zhì)暴露時,真菌可以通過破損處侵入上皮下層及基質(zhì)層,引起真菌性角膜炎。角膜上皮細胞參與宿主的固有免疫反應,抵抗真菌入侵。角膜上皮細胞(Corneal epithelial cells)是構成角膜天然免疫防御系統(tǒng)的主要組成細胞,是抵抗病原微生物感染的第一道防線。因此,角膜上皮細胞識別病原微生物組分的生物學功能是非常重要的。由真菌引起的宿主角膜天然免疫應答有賴于其模式識別受體家族(Pattern recognition receptors, PRRs)對特定病原體的快速識別,如Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)。PRRs的活化引發(fā)一系列的炎癥信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應,包括炎性細胞的浸潤(多形核嗜中性粒細胞和單核細胞／巨噬細胞),Th2型細胞因子(IL-4,IL-6和IL-10),趨化因子(IL-8),促炎性細胞因子(TNF-α和IL-的1β)和抗菌肽(hBD2及LL37)的生成,從而清除病原體。本課題組在前期研究中率先證實,TLR2和TLR4是角膜上皮細胞識別細胞外煙曲霉菌的主要受體,通過激活多個信號轉(zhuǎn)導通路(NF-κB和ERK)介導促炎癥細胞因子的產(chǎn)生。但是,TLR2和TLR4受體主要位于角膜上皮細胞的細胞膜上,是否還存在其他模式識別受體能夠識別侵入胞內(nèi)的真菌目前尚不清楚。 最近的研究顯示模式識別受體的另一個家族,核苷酸結合寡聚化結構域(Nucleotide-binding oligomerization domain, NOD)蛋白家族,能識別侵入細胞的“內(nèi)部”信號("inside-in"signalling),以“細胞內(nèi)監(jiān)視”的方式調(diào)控機體的天然免疫防御機制。其中,NOD1能識別特定的細菌成分二氨基庚二酸(y-D-glutamyl-meso-diaminopilemic acids, iE-DAP),其通過激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和MAPK信號傳導通路誘導炎性細胞因子的分泌和抗菌肽的生成,啟動宿主細胞防御病原體感染的固有免疫反應。目前的研究揭示NOD1在多種器官,如肺,腸和口腔的病毒和真菌感染中都發(fā)揮著至關重要的作用。然而,NOD1在人角膜上皮細胞(Human comeal epithelial cells, HCECs)抗真菌的天然免疫炎癥反應中的作用我們卻知之甚少。 目前的研究發(fā)現(xiàn),NOD蛋白與真菌感染密切相關。Zhang HJ等發(fā)現(xiàn)NOD蛋白在煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus,A. fumigatus)分生孢子感染小鼠肺組織的天然免疫反應中發(fā)揮著重要的作用。那么,在人角膜上皮細胞中,NODs如何識別真菌,發(fā)揮抗真菌作用?具體機制如何?回答這些問題將更清楚地揭示角膜識別真菌、啟動免疫防御反應的機理,對角膜抗真菌感染免疫調(diào)控及角膜天然免疫提供全新的理論,為角膜真菌感染的防治、新藥的靶點設計及新型疫苗的開發(fā)開辟新的思路,有重要的臨床意義和社會價值。因此,本研究采用NOD1特異性配體iE-DAP和熱滅活的煙曲霉菌分生孢子作為干擾因素,觀察人永生化角膜上皮細胞(Human telomerase-immortalized corneal epithelial cells, THCEs)中NOD1,炎性細胞因子(TNF-α、IL-6和IL-8)以及抗菌肽(hBD2、LL37)的表達變化,探討NOD1在人角膜上皮細胞中的作用及機制。全文共分兩部分：(一)NOD1蛋白在煙曲霉菌感染人角膜上皮細胞固有免疫反應中的表達與作用的研究；(二)NOD1蛋白介導煙曲霉菌感染人角膜上皮細胞固有免疫反應中的作用機制的研究。 第一部分NOD1在煙曲霉菌感染人角膜上皮細胞固有免疫反應中的表達及作用的研究 [目的] 研究核苷酸結合寡聚化結構域(Nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)相關蛋白NOD1在煙曲霉菌感染人角膜上皮細胞引起的天然免疫反應過程中的表達與作用。 [方法] 1.用F12/DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人永生化角膜上皮細胞,將培養(yǎng)的人永生化角膜上皮細胞隨機分為3組：實驗組1,2和空白對照組,3組分別更換NOD1的特異性配體(iE-DAP,20μg/ml)、熱滅活的煙曲霉菌孢子刺激液、F12/DMEM培養(yǎng)液,Oh,1h,2h,4h,8h,12h,24h后收集細胞及上清液； 2.根據(jù)基因組數(shù)據(jù)庫設計靶向人NOD1的siRNA序列,用F12/DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人永生化角膜上皮細胞,將培養(yǎng)的人永生化角膜上皮細胞隨機分為2組：實驗組和陰性對照組,NOD1-siRNA轉(zhuǎn)染實驗組THCEs24h后,再用熱滅活的煙曲霉菌孢子刺激液(1×105個/m1)分別刺激2組細胞,4h后收取細胞及上清液； 3. Real-time RT-PCR檢測不同刺激下THCEs中NOD1,抗菌肽LL37及hBD2mRNA的表達；Western Blotting檢測NOD1的表達；免疫熒光檢測NOD1蛋白的表達變化；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞上清液中的TNF-α、IL-6和IL-8的分泌,并進行統(tǒng)計學分析。 [結果] NOD1特異性配體iE-DAP及煙曲霉菌孢子均可刺激THCEs中NOD1的mRNA以及蛋白的表達呈時間依賴性增高,炎性細胞因子TNF-α、IL-6和IL-8和抗菌肽LL37,hBD2mRNA的分泌增多。NOD1-siRNA轉(zhuǎn)染THCEs后,NOD1mRNA以及蛋白水平均受到顯著抑制。敲除NOD1能減弱煙曲霉菌誘導的NOD1表達增高,炎性因子和抗菌肽的分泌增加。 [結論] NOD1配體可誘導角膜上皮細胞的天然免疫反應；角膜上皮細胞通過NOD1識別胞內(nèi)的煙曲霉菌并介導炎性細胞因子和抗菌肽的分泌。因此,NOD1是角膜上皮細胞抗真菌天然免疫反應中的關鍵因素,表明NOD1可能是真菌性角膜炎治療中一個潛在的新的治療靶點。 第二部分NOD1蛋白介導煙曲霉菌感染人角膜上皮細胞固有免疫反應中的作用機制的研究 [目的] 研究NOD1在煙曲霉菌誘導的人角膜上皮細胞的固有免疫反應中的關鍵信號轉(zhuǎn)導通路。 [方法] 1.用F12/DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人永生化角膜上皮細胞,將培養(yǎng)的人永生化角膜上皮細胞隨機分為3組：實驗組1,2和空白對照組,3組分別更換NOD1的特異性配體(iE-DAP,20μg/ml)、熱滅活的煙曲霉菌孢子刺激液、F12/DMEM培養(yǎng)液,Oh,1h,2h,4h,8h,12h,24h后收集細胞及上清液； 2.根據(jù)基因組數(shù)據(jù)庫設計靶向人NOD1的siRNA序列,用F12/DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人永生化角膜上皮細胞,將培養(yǎng)的人永生化角膜上皮細胞隨機分為2組：實驗組和陰性對照組,NOD1-siRNA轉(zhuǎn)染實驗組THCEs24h后,再用熱滅活的煙曲霉菌孢子刺激液(1×105個/m1)分別刺激2組細胞,4h后收取細胞及上清液； 3. Real-time RT-PCR檢測不同刺激下THCEs中NOD1,下游信號轉(zhuǎn)導通路中的關鍵分子RIP2、NF-κB p65,抗菌肽LL37及hBD2mRNA的表達：Western Blotting檢測NOD1及信號通路分子RIP2、NF-κB p65的表達；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞上清液中的TNF-α、IL-6和IL-8的分泌,并進行統(tǒng)計學分析。 [結果] NOD1siRNA轉(zhuǎn)染人角膜上皮細胞后,NOD1mRNA以及蛋白水平表達均受到顯著抑制。iE-DAP或熱滅活的煙曲霉菌孢子刺激THCEs后,對照組下游信號轉(zhuǎn)導通路中的關鍵分子RIP2、NF-κB p65,炎性細胞因子TNF-α、IL-6和IL-8及抗菌肽LL37和hBD2的表達上調(diào),而NOD1siRNA處理組下游信號轉(zhuǎn)導通路中的關鍵分子,炎性細胞因子及抗菌肽的分泌較對照組明顯降低。 [結論] 在角膜上皮細胞固有免疫系統(tǒng)中,NOD1作為關鍵的受體,能特異性的介導NOD1特異性配體或煙曲霉菌孢子引起的機體天然免疫反應。而RIP2依賴的NF-κB信號傳導途徑中關鍵因子的表達變化在介導煙曲霉菌誘導的宿主天然免疫反應中可能起著關鍵性的作用。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2014
【中圖分類】：R772.21
【部分圖文】：

siRNA Sequence(5' —> 3')hs-NODl-si-1 Sense CCAGACGUUAAAGCAUUUAdTdThs-NODl-si-1 Antisense UAAAUGCUUUAACGUCUGGdTdThs-NODl-si-2 Sense GCGAAGAGCUGACCAAAUAdTdThs-NODl-si-2 Antisense UAUUUGGUCAGCUCUUCGCdTdThs-NODl-si-3 Sense GGGUGAGACCAUCUUCAUCdTdThs-NODl-si-3 Antisense GAUGAAGAUGGUCUCACCCdTdTFluorescent labeled non-silencing Sense UUCUCCGAACGUGUCACGUTTsiRNA as the negative control Antisense TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA表1 NODI siRNA及對照siRNA序列

圖6 NODI SiRNA有效抑制THCEs中NODI的表達及阻斷煙曲霉菌誘導的炎性細胞因子及抗菌肽的分泌。N0D1 siRNA轉(zhuǎn)染THCEs 48小時后，再用熱滅活的煙曲霉菌分生抱子刺激THCEs 4小時后收取細胞以及細胞上清液，A應用實時定量RT-PCR檢測N0D1 mRNA的表達，B應用Western Blot檢測NODI蛋白水平的表達，C應用實時定量RT-PCR檢測hBD2和LL37的表達，D應用ELISA檢測 IL-6，IL-8 和 TNF-a 的分泌。（尸<0.05，**P<0.01 compared with the mediumgroup )
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本文編號：2869932