研究背景 真菌性角膜炎(Fungal keratitis)是一種潛在的威脅視力的疾病,近年來在美國(guó)和中國(guó)的發(fā)病率急劇增加,因此需要及時(shí)準(zhǔn)確的診斷和積極的治療,以防止視力下降。在美國(guó)和其他工業(yè)化國(guó)家,長(zhǎng)期佩戴隱形眼鏡是真菌性角膜炎的首要原因；而在發(fā)展中國(guó)家,農(nóng)業(yè)勞動(dòng)是主要的危險(xiǎn)因素。近年來,隨著免疫抑制劑的廣泛使用,長(zhǎng)期使用廣譜抗生素和艾滋病也被視為真菌性角膜炎的危險(xiǎn)因素。真菌性角膜炎是感染性角膜病中最具挑戰(zhàn)性的疾病之一,近幾年,真菌性角膜炎發(fā)病率已上升到感染性角膜病的首位(占51%-70%),因此,真菌性角膜炎的防治研究已成為我國(guó)致盲性眼病的重大科學(xué)問題。真菌性角膜炎在熱帶、亞熱帶地區(qū)發(fā)病率高,有超過105種真菌可引起眼部感染,主要是鐮孢屬、彎孢屬、曲霉屬和念珠菌屬四大類,而在我們國(guó)家,真菌性角膜炎主要致病菌為鐮刀菌屬,約占感染病例的70%-80%,次之為曲霉菌屬,約占10%,念珠菌屬只占2%。因此,只有更好地理解角膜抗真菌感染的免疫防御分子機(jī)制才能更好地制定詳細(xì)的治療策略。 一般情況下,真菌不會(huì)侵犯正常角膜,但當(dāng)角膜上皮破壞,角膜基質(zhì)暴露時(shí),真菌可以通過破損處侵入上皮下層及基質(zhì)層,引起真菌性角膜炎。角膜上皮細(xì)胞參與宿主的固有免疫反應(yīng),抵抗真菌入侵。角膜上皮細(xì)胞(Corneal epithelial cells)是構(gòu)成角膜天然免疫防御系統(tǒng)的主要組成細(xì)胞,是抵抗病原微生物感染的第一道防線。因此,角膜上皮細(xì)胞識(shí)別病原微生物組分的生物學(xué)功能是非常重要的。由真菌引起的宿主角膜天然免疫應(yīng)答有賴于其模式識(shí)別受體家族(Pattern recognition receptors, PRRs)對(duì)特定病原體的快速識(shí)別,如Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)。PRRs的活化引發(fā)一系列的炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng),包括炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)(多形核嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞／巨噬細(xì)胞),Th2型細(xì)胞因子(IL-4,IL-6和IL-10),趨化因子(IL-8),促炎性細(xì)胞因子(TNF-α和IL-的1β)和抗菌肽(hBD2及LL37)的生成,從而清除病原體。本課題組在前期研究中率先證實(shí),TLR2和TLR4是角膜上皮細(xì)胞識(shí)別細(xì)胞外煙曲霉菌的主要受體,通過激活多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(NF-κB和ERK)介導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。但是,TLR2和TLR4受體主要位于角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上,是否還存在其他模式識(shí)別受體能夠識(shí)別侵入胞內(nèi)的真菌目前尚不清楚。 最近的研究顯示模式識(shí)別受體的另一個(gè)家族,核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(Nucleotide-binding oligomerization domain, NOD)蛋白家族,能識(shí)別侵入細(xì)胞的“內(nèi)部”信號(hào)("inside-in"signalling),以“細(xì)胞內(nèi)監(jiān)視”的方式調(diào)控機(jī)體的天然免疫防御機(jī)制。其中,NOD1能識(shí)別特定的細(xì)菌成分二氨基庚二酸(y-D-glutamyl-meso-diaminopilemic acids, iE-DAP),其通過激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的分泌和抗菌肽的生成,啟動(dòng)宿主細(xì)胞防御病原體感染的固有免疫反應(yīng)。目前的研究揭示NOD1在多種器官,如肺,腸和口腔的病毒和真菌感染中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。然而,NOD1在人角膜上皮細(xì)胞(Human comeal epithelial cells, HCECs)抗真菌的天然免疫炎癥反應(yīng)中的作用我們卻知之甚少。 目前的研究發(fā)現(xiàn),NOD蛋白與真菌感染密切相關(guān)。Zhang HJ等發(fā)現(xiàn)NOD蛋白在煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus,A. fumigatus)分生孢子感染小鼠肺組織的天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。那么,在人角膜上皮細(xì)胞中,NODs如何識(shí)別真菌,發(fā)揮抗真菌作用?具體機(jī)制如何?回答這些問題將更清楚地揭示角膜識(shí)別真菌、啟動(dòng)免疫防御反應(yīng)的機(jī)理,對(duì)角膜抗真菌感染免疫調(diào)控及角膜天然免疫提供全新的理論,為角膜真菌感染的防治、新藥的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及新型疫苗的開發(fā)開辟新的思路,有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。因此,本研究采用NOD1特異性配體iE-DAP和熱滅活的煙曲霉菌分生孢子作為干擾因素,觀察人永生化角膜上皮細(xì)胞(Human telomerase-immortalized corneal epithelial cells, THCEs)中NOD1,炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6和IL-8)以及抗菌肽(hBD2、LL37)的表達(dá)變化,探討NOD1在人角膜上皮細(xì)胞中的作用及機(jī)制。全文共分兩部分：(一)NOD1蛋白在煙曲霉菌感染人角膜上皮細(xì)胞固有免疫反應(yīng)中的表達(dá)與作用的研究；(二)NOD1蛋白介導(dǎo)煙曲霉菌感染人角膜上皮細(xì)胞固有免疫反應(yīng)中的作用機(jī)制的研究。 第一部分NOD1在煙曲霉菌感染人角膜上皮細(xì)胞固有免疫反應(yīng)中的表達(dá)及作用的研究 [目的] 研究核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(Nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)相關(guān)蛋白NOD1在煙曲霉菌感染人角膜上皮細(xì)胞引起的天然免疫反應(yīng)過程中的表達(dá)與作用。 [方法] 1.用F12/DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人永生化角膜上皮細(xì)胞,將培養(yǎng)的人永生化角膜上皮細(xì)胞隨機(jī)分為3組：實(shí)驗(yàn)組1,2和空白對(duì)照組,3組分別更換NOD1的特異性配體(iE-DAP,20μg/ml)、熱滅活的煙曲霉菌孢子刺激液、F12/DMEM培養(yǎng)液,Oh,1h,2h,4h,8h,12h,24h后收集細(xì)胞及上清液； 2.根據(jù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)靶向人NOD1的siRNA序列,用F12/DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人永生化角膜上皮細(xì)胞,將培養(yǎng)的人永生化角膜上皮細(xì)胞隨機(jī)分為2組：實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組,NOD1-siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組THCEs24h后,再用熱滅活的煙曲霉菌孢子刺激液(1×105個(gè)/m1)分別刺激2組細(xì)胞,4h后收取細(xì)胞及上清液； 3. Real-time RT-PCR檢測(cè)不同刺激下THCEs中NOD1,抗菌肽LL37及hBD2mRNA的表達(dá)；Western Blotting檢測(cè)NOD1的表達(dá)；免疫熒光檢測(cè)NOD1蛋白的表達(dá)變化；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞上清液中的TNF-α、IL-6和IL-8的分泌,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 [結(jié)果] NOD1特異性配體iE-DAP及煙曲霉菌孢子均可刺激THCEs中NOD1的mRNA以及蛋白的表達(dá)呈時(shí)間依賴性增高,炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-8和抗菌肽LL37,hBD2mRNA的分泌增多。NOD1-siRNA轉(zhuǎn)染THCEs后,NOD1mRNA以及蛋白水平均受到顯著抑制。敲除NOD1能減弱煙曲霉菌誘導(dǎo)的NOD1表達(dá)增高,炎性因子和抗菌肽的分泌增加。 [結(jié)論] NOD1配體可誘導(dǎo)角膜上皮細(xì)胞的天然免疫反應(yīng)；角膜上皮細(xì)胞通過NOD1識(shí)別胞內(nèi)的煙曲霉菌并介導(dǎo)炎性細(xì)胞因子和抗菌肽的分泌。因此,NOD1是角膜上皮細(xì)胞抗真菌天然免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵因素,表明NOD1可能是真菌性角膜炎治療中一個(gè)潛在的新的治療靶點(diǎn)。 第二部分NOD1蛋白介導(dǎo)煙曲霉菌感染人角膜上皮細(xì)胞固有免疫反應(yīng)中的作用機(jī)制的研究 [目的] 研究NOD1在煙曲霉菌誘導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞的固有免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 [方法] 1.用F12/DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人永生化角膜上皮細(xì)胞,將培養(yǎng)的人永生化角膜上皮細(xì)胞隨機(jī)分為3組：實(shí)驗(yàn)組1,2和空白對(duì)照組,3組分別更換NOD1的特異性配體(iE-DAP,20μg/ml)、熱滅活的煙曲霉菌孢子刺激液、F12/DMEM培養(yǎng)液,Oh,1h,2h,4h,8h,12h,24h后收集細(xì)胞及上清液； 2.根據(jù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)靶向人NOD1的siRNA序列,用F12/DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人永生化角膜上皮細(xì)胞,將培養(yǎng)的人永生化角膜上皮細(xì)胞隨機(jī)分為2組：實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組,NOD1-siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組THCEs24h后,再用熱滅活的煙曲霉菌孢子刺激液(1×105個(gè)/m1)分別刺激2組細(xì)胞,4h后收取細(xì)胞及上清液； 3. Real-time RT-PCR檢測(cè)不同刺激下THCEs中NOD1,下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子RIP2、NF-κB p65,抗菌肽LL37及hBD2mRNA的表達(dá)：Western Blotting檢測(cè)NOD1及信號(hào)通路分子RIP2、NF-κB p65的表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞上清液中的TNF-α、IL-6和IL-8的分泌,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 [結(jié)果] NOD1siRNA轉(zhuǎn)染人角膜上皮細(xì)胞后,NOD1mRNA以及蛋白水平表達(dá)均受到顯著抑制。iE-DAP或熱滅活的煙曲霉菌孢子刺激THCEs后,對(duì)照組下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子RIP2、NF-κB p65,炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-8及抗菌肽LL37和hBD2的表達(dá)上調(diào),而NOD1siRNA處理組下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子,炎性細(xì)胞因子及抗菌肽的分泌較對(duì)照組明顯降低。 [結(jié)論] 在角膜上皮細(xì)胞固有免疫系統(tǒng)中,NOD1作為關(guān)鍵的受體,能特異性的介導(dǎo)NOD1特異性配體或煙曲霉菌孢子引起的機(jī)體天然免疫反應(yīng)。而RIP2依賴的NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑中關(guān)鍵因子的表達(dá)變化在介導(dǎo)煙曲霉菌誘導(dǎo)的宿主天然免疫反應(yīng)中可能起著關(guān)鍵性的作用。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R772.21
【部分圖文】：

siRNA Sequence(5' —> 3')hs-NODl-si-1 Sense CCAGACGUUAAAGCAUUUAdTdThs-NODl-si-1 Antisense UAAAUGCUUUAACGUCUGGdTdThs-NODl-si-2 Sense GCGAAGAGCUGACCAAAUAdTdThs-NODl-si-2 Antisense UAUUUGGUCAGCUCUUCGCdTdThs-NODl-si-3 Sense GGGUGAGACCAUCUUCAUCdTdThs-NODl-si-3 Antisense GAUGAAGAUGGUCUCACCCdTdTFluorescent labeled non-silencing Sense UUCUCCGAACGUGUCACGUTTsiRNA as the negative control Antisense TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA表1 NODI siRNA及對(duì)照siRNA序列

圖6 NODI SiRNA有效抑制THCEs中NODI的表達(dá)及阻斷煙曲霉菌誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子及抗菌肽的分泌。N0D1 siRNA轉(zhuǎn)染THCEs 48小時(shí)后，再用熱滅活的煙曲霉菌分生抱子刺激THCEs 4小時(shí)后收取細(xì)胞以及細(xì)胞上清液，A應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)N0D1 mRNA的表達(dá)，B應(yīng)用Western Blot檢測(cè)NODI蛋白水平的表達(dá)，C應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)hBD2和LL37的表達(dá)，D應(yīng)用ELISA檢測(cè) IL-6，IL-8 和 TNF-a 的分泌。（尸<0.05，**P<0.01 compared with the mediumgroup )
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本文編號(hào)：2869932