目的:通過原代細(xì)胞培養(yǎng)、分離,獲得純化的眼瞼基底細(xì)胞癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)、眼瞼良性腫瘤皮內(nèi)痣相關(guān)成纖維細(xì)胞(BAFs)及正常眼瞼皮膚成纖維細(xì)胞(NFs),并檢測(cè)三種不同成纖維細(xì)胞表達(dá)成纖維活化蛋白(FAP)的差異,進(jìn)一步探討CAFs表達(dá)FAP在眼瞼基底細(xì)胞癌中的作用及意義。方法:(1)用組織塊貼壁法培養(yǎng)獲得原代眼瞼基底細(xì)胞癌CAFs、眼瞼良性腫瘤皮內(nèi)痣相關(guān)成纖維細(xì)胞(BAFs)及眼瞼正常皮膚NFs,胰酶差速消化法和反復(fù)傳代培養(yǎng)法進(jìn)行細(xì)胞分離、純化;(2)在倒置相差顯微鏡下觀察CAFs、BAFs及NFs細(xì)胞形態(tài),運(yùn)用免疫細(xì)胞組織化學(xué)染色法檢測(cè)三種成纖維細(xì)胞中波形蛋白(VIM)、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、細(xì)胞角蛋白(CK)及FAP表達(dá)情況并對(duì)其進(jìn)行鑒定;(3)采用MTT比色法檢測(cè)3種細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖活力并繪制生長(zhǎng)曲線;通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)法檢測(cè)CAFs、BAFs及NFs細(xì)胞中FAP的mRNA表達(dá)差異;應(yīng)用蛋白免疫印跡(Western Blot)方法檢測(cè)CAFs、BAFs及NFs中FAP蛋白表達(dá)差異。結(jié)果:(1)成功獲得純化的眼瞼CAFs、BAFs及NFs。(2)眼瞼CAFs呈紡錘形或長(zhǎng)梭形,細(xì)胞大小不一,胞質(zhì)突減少,胞漿內(nèi)較多顆粒,增殖較快,排列紊亂不規(guī)則,重疊生長(zhǎng)現(xiàn)象明顯,喪失接觸抑制現(xiàn)象;BAFs生長(zhǎng)速度介于CAFs與NFs之間,細(xì)胞多數(shù)呈長(zhǎng)梭形,放射狀排列,可有重疊生長(zhǎng)現(xiàn)象,部分接觸抑制作用喪失;NFs呈長(zhǎng)梭形,放射狀排列,增殖速度較CAFs及BAFs慢,胞漿內(nèi)顆粒少見,無重疊生長(zhǎng)現(xiàn)象,存在接觸抑制。(3)細(xì)胞免疫化學(xué)染色,CAFs組VIM(+)、α-SMA(+)、FAP(+),CK(-);BAFs組VIM(+),α-SMA和FAP表達(dá)陰性或弱陽性,CK(-);NFs組VIM(+),CK(-)、α-SMA(-)及FAP(-)。(4)RTQ-PCR法檢測(cè)CAFs、BAFs、NFs三種不同組織來源的成纖維細(xì)胞FAP mRNA擴(kuò)增含量分別為:3.6715±0.2212,1.4810±0.0904,1.0340±0.0236,用ONE-WAY ANOVA中SNK法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=103.676,P0.005)。Western Blot法檢測(cè)3組細(xì)胞中FAP蛋白表達(dá)水平,與其內(nèi)參蛋白相比較,顯示CAFs高表達(dá)FAP蛋白,BAFs不表達(dá)或弱表達(dá),NFs組不表達(dá),存在明顯差異。結(jié)論:腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,其微環(huán)境中成纖維細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、分泌功能等方面發(fā)生了變化。眼瞼基底細(xì)胞癌CAFs、眼瞼良性腫瘤BAFs及眼瞼正常皮膚NFs生物學(xué)特性(如形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)增殖、生長(zhǎng)因子表達(dá)等方面)存在顯著差異。提示眼瞼基底細(xì)胞癌腫瘤微環(huán)境發(fā)生了變化,進(jìn)一步誘導(dǎo)NFs生物學(xué)特性和功能發(fā)生變化,轉(zhuǎn)變?yōu)锽AFs及CAFs。CAFs、BAFs及NFs中FAP表達(dá)差異顯著,且與腫瘤惡性程度相關(guān),提示FAP在眼瞼基底細(xì)胞癌中可能發(fā)揮著重要作用,可作為眼瞼基底細(xì)胞癌診斷和治療的一個(gè)新的靶點(diǎn),但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。
【學(xué)位單位】：川北醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R739.71
【部分圖文】：

CAFs BAFs NFs圖 1 患者標(biāo)本來源圖片注：從左往右依次為 CAFs、BAFs 及 NFs 標(biāo)本來源CAFs BAFs NFs圖 2 細(xì)胞培養(yǎng)（倒置相差顯微鏡觀察）注：從左往右依次為 CAFs、BAFs、NFs；基底細(xì)胞癌 CAFs 從組織塊邊緣呈放射狀爬出，細(xì)胞排列較緊密，出現(xiàn)重疊現(xiàn)象（×100）；BAFs 從組織塊邊緣呈放射狀爬出，細(xì)胞較散在，有部分重疊現(xiàn)象（×100）；NFs 從組織塊邊緣散在爬出，細(xì)胞排列較松散，緊密接觸不明顯（×100）。

CAFs BAFs NFs圖 2 細(xì)胞培養(yǎng)（倒置相差顯微鏡觀察）注：從左往右依次為 CAFs、BAFs、NFs；基底細(xì)胞癌 CAFs 從組織塊邊緣呈放射狀爬出，細(xì)胞排列較緊密，出現(xiàn)重疊現(xiàn)象（×100）；BAFs 從組織塊邊緣呈放射狀爬出，細(xì)胞較散在，有部分重疊現(xiàn)象（×100）；NFs 從組織塊邊緣散在爬出，細(xì)胞排列較松散，緊密接觸不明顯（×100）。

32圖 3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色第 3 代 CAFs 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 CK 陰性（SPx400）, VIM、α-SMA、FAP 均陽性（SPx400）； 代 BAFs 免疫組化染色 VIM 陽性（SPx400），CK 陰性（SPx400），α-SMA、FAP 陰性或性（SPx400）；第 3 代 NFs 免疫細(xì)胞化學(xué)染色僅 VIM 陽性（SPx400），CK、α-SMA、FAP性（SPx400）。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王曉翊;韓方;唐慧娟;王澤華;;卵巢癌相關(guān)成纖維細(xì)胞和正常卵巢成纖維細(xì)胞的基因表達(dá)差異[J];中國(guó)婦幼保健;2011年06期

本文編號(hào)：2864703