發(fā)布時(shí)間：2020-11-01 15:56

　　 [目的]本研究通過(guò)使用新一代測(cè)序(轉(zhuǎn)錄組測(cè)序)技術(shù)來(lái)獲得鼻咽癌放療前后的血液lncRNA差異表達(dá)譜,研究lncRNA在鼻咽癌中的作用機(jī)制,并為尋找鼻咽癌放療敏感相關(guān)的血液lncRNA標(biāo)記物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為鼻咽癌臨床個(gè)體化放療提供支持。[方法]選取單純接受放射治療的鼻咽癌患者作為研究對(duì)象,收集研究對(duì)象的放療前以及標(biāo)準(zhǔn)放療后的外周靜脈血標(biāo)本,提取其中的RNA,檢測(cè)總RNA純度,通過(guò)采用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)放療前后lncRNA的表達(dá)量變化,從而獲得鼻咽癌放療前后lncRNA的差異表達(dá)譜,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)對(duì)差異表達(dá)譜進(jìn)行驗(yàn)證。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,運(yùn)用基因本體論(GO)分析和通路富集分析方法,對(duì)差異表達(dá)的lncRNA及其靶基因進(jìn)行分析,獲得與鼻咽癌放療敏感性相關(guān)的信號(hào)通路和可能參與的細(xì)胞成分、分子功能以及生物學(xué)過(guò)程。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR,在30例鼻咽癌患者中檢測(cè)lnc-CRTC3-3的相對(duì)表達(dá)量,并分析其與鼻咽癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。利用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。[結(jié)果]1.全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序lncRNA檢測(cè)結(jié)果:共有1097個(gè)lncRNAs在放療前后的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值0.05,且log2(fold change)的絕對(duì)值0),包括418個(gè)表達(dá)上調(diào)的lncRNAs和679個(gè)表達(dá)下調(diào)的lncRNAs。2.基因本體論(GO)分析結(jié)果:通過(guò)對(duì)差異表達(dá)lncRNA的靶基因進(jìn)行GO富集分析得到:富集程度最高的生物學(xué)過(guò)程(BP)是細(xì)胞過(guò)程(cellular process),富集程度最高的細(xì)胞成分(CC)是細(xì)胞內(nèi)部分(intracellular part),富集程度最高的分子功能(MF)是蛋白質(zhì)結(jié)合功能(protein binding)。3.KEGG富集通路分析結(jié)果:我們將差異表達(dá)lncRNA的靶基因進(jìn)行KEGG富集分析得到10條相關(guān)信號(hào)通路,其中比較關(guān)鍵的通路是N-聚糖生物合成通路。4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)差異表達(dá)譜的驗(yàn)證結(jié)果:實(shí)驗(yàn)各選取2個(gè)變化明顯的上調(diào)lncRNA(lnc-SURF2-1、lnc-KXD1-1)和下調(diào)lncRNA(lnc-EPS8L2-3、lnc-CRTC3-3),并檢測(cè)它們?cè)诒茄拾┓暖熐凹胺暖熀蟮难簶颖局械谋磉_(dá)情況,結(jié)果證實(shí)基因上調(diào)和下調(diào)的趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果一致。5.lnc-CRTC3-3在鼻咽癌中的表達(dá)及其與鼻咽癌臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性分析結(jié)果:lnc-CRTC3-3的表達(dá)水平與鼻咽癌患者臨床分期(P=0.0125),分化程度(P=0.0031)及放射敏感性(P=0.0139)密切相關(guān),而lnc-CRTC3-3的表達(dá)水平與患者的性別、年齡、是否有吸煙史、有否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移沒(méi)有明顯的相關(guān)性。[結(jié)論]1.獲得了NPC放療敏感性相關(guān)的lncRNAs差異表達(dá)譜。2.lncRNA通過(guò)相關(guān)信號(hào)通路影響NPC細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。3.lnc-CRTC3-3的表達(dá)水平與鼻咽癌患者臨床分期、分化程度以及與放療的敏感性密切相關(guān);lnc-CRTC3-3有可能成為鼻咽癌預(yù)測(cè)放療敏感性的潛在標(biāo)志物。
【學(xué)位單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R739.63
【部分圖文】：

第 3 章 結(jié)果RNA 質(zhì)檢結(jié)果測(cè)的放療前及標(biāo)準(zhǔn)放療后的血液樣本的 RNA 質(zhì)量與總量，清晰的 5s，18s，28s 條帶，無(wú)明顯降解（圖 3.1）；2260/280≥1.8 ，28S/18S≥1.0（表 3.1）；3、RIN≥6.5（圖果

圖 3.1 總 RNA 電泳結(jié)果M：Marker；1：放療前；2：放療后2）Qubit 檢測(cè)結(jié)果表 3.1 放療前后樣本 RNA 定量檢測(cè)樣本 樣本名 OD260/280 濃度 (ng/μL) 體積 (μL) 總量 (μg1 放療前 2.10 175 30 5.252 放療后 2.02 120 30 4.603) 2100 檢測(cè)結(jié)果

采用 Illumina 測(cè)序平臺(tái)，2×150bp 雙端測(cè)序策略對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。3.2.1 測(cè)序原始數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估1）本實(shí)驗(yàn)測(cè)序數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì)（見(jiàn)表 3.2）表 3.2 測(cè)序數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì)樣本名稱 原始序列數(shù) 原始?jí)A基數(shù) Q20 Q30 GC%放療前 186587058 25852691943 95.51% 90.10% 56.25%放療后 188234336 25969814702 95.91% 90.79% 56.70%注：原始序列數(shù)（Raw reads）表示各樣本的總序列數(shù)，原始?jí)A基數(shù)（Raw bases）表示各樣本的堿基總數(shù)，Q20 表示堿基的測(cè)序錯(cuò)誤率在 1%以下 reads 所占比例，Q30 表示堿基的測(cè)序錯(cuò)誤率在 0.1% 以下 reads 所占比例，GC%表示各樣本中 reads 的平均 GC 含量百分?jǐn)?shù)。2）本實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)堿基質(zhì)量分布（見(jiàn)圖 3.3）
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2865760