目的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2(Extracellular signal regulated kinase,ERK2)和眼缺失基因3(eyes absent,EYA3)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但其調(diào)控視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不十分明確。為了進(jìn)一步探索它們?cè)谝暰W(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展中所起到功能及作用,本實(shí)驗(yàn)分別構(gòu)建Myc-ERK2和EYA3小干擾RNA(siRNA)的真核表達(dá)載體,并利用生長(zhǎng)曲線檢測(cè)其對(duì)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(WERI-Rb-1)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。有望為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展提供有價(jià)值的理論依據(jù)。方法采用PCR技術(shù)從本實(shí)驗(yàn)室保存的人乳腺文庫(kù)中擴(kuò)增目的基因ERK2序列,并將其正確插入到Myc載體中。將Myc空載體和Myc-ERK2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,利用Western blot印跡來(lái)檢測(cè)表達(dá)情況,通過(guò)生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ERK2對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(WERI-Rb-1)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。然后,根據(jù)EYA3的cDNA序列,設(shè)計(jì)并構(gòu)建EYA3 siRNA真核表達(dá)載體。將EYA3 siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后,通過(guò)利用RT-PCR和Western blot印跡實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)EYA3基因的表達(dá)水平。將構(gòu)建的EYA3 siRNA重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染W(wǎng)ERI-Rb-1細(xì)胞,并利用生長(zhǎng)曲線檢測(cè)EYA3對(duì)WERI-Rb-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果成功獲得了Myc-ERK2和EYA3小干擾RNA(siRNA)的重組質(zhì)粒。通過(guò)雙酶切和測(cè)序鑒定表明,Myc-ERK2真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功,Western blot印跡表明Myc-ERK2在HEK293T細(xì)胞中成功表達(dá),細(xì)胞生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)表明Myc-ERK2對(duì)WERI-Rb-1細(xì)胞的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。通過(guò)RT-PCR和Western印跡分別檢測(cè)EYA3基因的表達(dá),說(shuō)明構(gòu)建的EYA3 siRNA能夠抑制EYA3基因的表達(dá),細(xì)胞生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)表明EYA3 siRNA對(duì)WERI-Rb-1細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功獲得了Myc-ERK2和EYA3 siRNA的重組質(zhì)粒。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可以得出結(jié)論:ERK2能夠促進(jìn)WERI-Rb-1細(xì)胞的生長(zhǎng),敲低EYA3能夠抑制WERI-Rb-1細(xì)胞的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步探究ERK2和EYA3在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的功能奠定了基礎(chǔ),為后續(xù)研究視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供新的理論平臺(tái)。
【學(xué)位單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R739.7
【部分圖文】：

ERK2 基因的瓊脂糖凝膠電: DNA marker；1: ERK2 PCR 產(chǎn)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定雙酶切的 PCR 產(chǎn)物和 Myc 載組質(zhì)粒雙酶切鑒定，凝膠電泳功插入到 Myc 標(biāo)簽中。測(cè)序結(jié)K2 構(gòu)建成功。

ERK2 基因的瓊脂糖凝膠電: DNA marker；1: ERK2 PCR 產(chǎn)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定雙酶切的 PCR 產(chǎn)物和 Myc 載組質(zhì)粒雙酶切鑒定，凝膠電泳功插入到 Myc 標(biāo)簽中。測(cè)序結(jié)K2 構(gòu)建成功。

2和空載體分別轉(zhuǎn)染HEK293T24h 后收取培養(yǎng)皿中的細(xì)胞 Sc-ERK2 蛋白的表達(dá)。通過(guò)上述K2 后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期一致，量約 4.3×104處可見(jiàn)明顯特異性胞中正確表達(dá)（圖 3）。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 劉燕;MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路在缺氧誘導(dǎo)的外層血—視網(wǎng)膜屏障損傷中的作用[D];中南大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2853153