目的 干眼是多因素疾病，炎癥作為一種防御反應(yīng)，是干眼最常見的病理表現(xiàn)。研究表明在干眼癥患者淚液和結(jié)膜上皮細(xì)胞中，炎癥因子TNF-α水平升高[1]。通過對干眼癥病人年齡、性別和干眼癥狀的分析，以及對結(jié)膜上皮細(xì)胞內(nèi)TNF-α的監(jiān)測，探討干眼癥病人眼表的炎癥狀態(tài)和臨床體征的關(guān)系。 鈉/氫交換體8（NHE8）是一種新型蛋白，其生理作用是通過細(xì)胞內(nèi)質(zhì)子與細(xì)胞外鈉離子進(jìn)行等比例的跨膜交換，從而調(diào)節(jié)pHi（細(xì)胞內(nèi)pH）穩(wěn)定，維持細(xì)胞體積，協(xié)同HCO-+3、NH4、Cl-等電解質(zhì)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)。NHE8蛋白主要分布在小腸刷狀緣，在腸道炎癥腹瀉中NHE8蛋白表達(dá)受TNF-α、干擾素-γ等炎性因子的抑制[2]。我們將小腸與結(jié)膜中鈉/氫交換體-8的表達(dá)進(jìn)行比較，意外地發(fā)現(xiàn)在結(jié)膜細(xì)胞內(nèi)NHE8高表達(dá)。本實驗探討在離體結(jié)膜細(xì)胞中，TNF-α對NHE8蛋白的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步完善NHE8在眼表細(xì)胞中的研究。 方法 1.病例來自沈陽軍區(qū)總醫(yī)院眼科2012年10月~2013年1月門診，以干眼為主訴的患者，做如下體征檢測：淚液分泌實驗（Schirmer’s Test），角膜熒光素鈉染色，BUT。 2.確診干眼癥病人并隨機(jī)選取16人，在確診無干眼癥的門診患者中隨機(jī)選取16人，分別作為病例組和對照組。 3.用結(jié)膜印跡細(xì)胞法分別收集兩組結(jié)膜細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后做實時定量PCR，檢測結(jié)膜中TNF-α表達(dá)水平。 4.免疫組織化學(xué)染色分析NHE8蛋白在人眼結(jié)膜的分布情況。 5.細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。 6.細(xì)胞免疫熒光染色。 7.信使RNA提取及蛋白提取技術(shù)，實時定量PCR和Western Blot。 8.構(gòu)建報告基因重組質(zhì)粒。 9.瞬時轉(zhuǎn)染和功能性啟動子分析。 10.采用Stata12.0總計軟件，計量資料比較用t檢驗，兩樣本率比較用卡方檢驗，指標(biāo)間相關(guān)性采用線性相關(guān)分析。P0.01表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 1.以干眼癥主訴就診的門診患者中: （1）干眼癥患病率為49%。 （2）其中45~50歲患者患病率達(dá)到相對峰值。 （3）女性患病人數(shù)明顯多于男性，卡方檢驗χ2=29.78，P0.01。 （4）病例組結(jié)膜上皮細(xì)胞內(nèi)TNF-α表達(dá)量高于對照組，t=7.31，P0.01。 （5）干眼癥患者結(jié)膜細(xì)胞內(nèi)，TNF-α表達(dá)與Schirmer’s Test成負(fù)相關(guān) R2=0.2583，p=0.000000.01；TNF-α表達(dá)與BUT成負(fù)相關(guān)R2=0.1435，p=0.0000490.01。 （6）人眼結(jié)膜細(xì)胞內(nèi)，NHE8蛋白初步定位于細(xì)胞膜上。 2.在人眼結(jié)膜上皮細(xì)胞系（CCL-20.2）中： （1）通過對NHE8蛋白和細(xì)胞核共免疫熒光染色，觀察到NHE8蛋白定位于質(zhì)膜； （2）不同濃度TNF-α抑制NHE8蛋白表達(dá)程度不同，25ng/ml TNF-α作用于結(jié)膜細(xì)胞，NHE8信使RNA含量與未處理組相比下降25%，t=4.69，P0.01，結(jié)果有顯著差異；50ng/ml TNF-α處理細(xì)胞，NHE8信使RNA含量表達(dá)下降32%，t=7.31，P0.01，結(jié)果有顯著差異；100ng/ml TNF-α培養(yǎng)細(xì)胞，NHE8信使RNA含量表達(dá)下降54%，t=7.31，P0.01，結(jié)果有顯著差異。 （3）在蛋白水平，三種不同濃度TNF-α處理細(xì)胞，NHE8蛋白表達(dá)均下降，TNF-α為25ng/ml時，NHE8蛋白含量與未處理組相比下降37%，t=7.31，P0.01，結(jié)果有顯著差異；濃度為50ng/m時，NHE8蛋白表達(dá)下降54%，t=7.31，P0.01，結(jié)果有顯著差異；100ng/ml TNF-α培養(yǎng)細(xì)胞，NHE8但你白表達(dá)下降75%，t=7.31，P0.01，結(jié)果有顯著差異。 （4）通過TNF-α濃度梯度實驗對NHE8基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達(dá)的影響，確定上藥濃度為25ng/ml。 （5）使用放線菌素D（Actinomycine D，AD）處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TNF-α對NHE8表達(dá)的抑制作用體現(xiàn)在基因轉(zhuǎn)錄水平。在TNF-α或AD處理下的結(jié)膜細(xì)胞中，NHE8表達(dá)減少量沒有統(tǒng)計學(xué)差異，在同時用TNF-α和AD處理后的細(xì)胞中，NHE8表達(dá)與單獨(dú)處理后表達(dá)沒有統(tǒng)計學(xué)差異，說明TNF-α抑制NHE8蛋白表達(dá)是通過抑制NHE8mRNA合成實現(xiàn)的。 （6）使用人NHE8基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TNF-α抑制NHE8基因啟動子序列在-671bp~-89bp之間。 結(jié)論 1.統(tǒng)計沈陽軍區(qū)總醫(yī)院眼科門診2012年10月~2013年1月期間，干眼癥病人數(shù)占總就診人數(shù)比例為48%，提示門診干眼癥患者患病率較高 2.患病率與年齡、性別有極大相關(guān)性 3.干眼癥病人結(jié)膜細(xì)胞內(nèi)TNF-α含量增高至45%，提示炎癥參與干眼癥疾病過程 4. TNF-α表達(dá)與Schirmer’s Test、BUT呈線性負(fù)相關(guān)，提示TNF-α在眼表的表達(dá)與干眼癥病情嚴(yán)重程度相關(guān)， 5.鈉/氫交換體（NHE8）8在人眼結(jié)膜細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，且分布于結(jié)膜細(xì)胞質(zhì)膜上。 6.體外實驗證實，炎癥因子TNF-α能夠誘導(dǎo)結(jié)膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，抑制NHE8基因啟動子活性，定位于NHE8基因的-671bp~-89bp啟動子區(qū)域。
【學(xué)位單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R777.34
【部分圖文】：

正常組和病例組Schirmer’s Test和BUT實驗結(jié)果比表 8 正常組和病例組 Schirmer’s Test 和 BUT 試驗結(jié)果比較Schiemer’s Test（mm） 13.5±0.59 4.7±0.53 10.13 0.0000 跡法取組織及 TNF-α 實時定量 PCR 反應(yīng)結(jié)果跡法，測得結(jié)膜上皮細(xì)胞 TNF-α基因含量測定如t=-7.31，P=0.0000（<0.01），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義胞內(nèi) TNF- α基因表達(dá)明顯高于對照組。

TNF-α為細(xì)胞內(nèi) TNF-α mRNA 表達(dá)量。每組 RNA 分別檢測基因 TNF-α/TBP（內(nèi)標(biāo)）結(jié)膜細(xì)胞中的表達(dá)含量。數(shù)據(jù)通過 3 次重復(fù)試驗的（mean±SE）匯總， * 代表 P<0.01與對照組的比較）4) 病例組 TNF-α 基因表達(dá)與 Schirmer 試驗、BUT 的相關(guān)性分析通過相關(guān)性分析，結(jié)果顯示在干眼癥患者結(jié)膜細(xì)胞內(nèi)，TNF-α表達(dá)與hirmer s Test 成負(fù)相關(guān)（R2=0.2583，p=0.00000<0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義）；NF-α表達(dá)與 BUT 成負(fù)相關(guān)（R2=0.1435，p=0.000049<0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意）。如表 9，圖 2、3。表 9 TNF-α 與 SchirmerTest、BUT、TNF-α 的相關(guān)性分析表Schirmer’s Test BUT0.2583 0.14350.000000 0.000049

圖 3 TNF-α 與 BUT 相關(guān)性5) 人眼結(jié)膜NHE8蛋白AEC染色由于人眼結(jié)膜樣本有限，我們只取一段結(jié)膜做AEC染色，宏觀上證實NHE8蛋白在結(jié)膜表達(dá)。見圖4。A B
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 潘以方,王光萍;干眼癥的檢查現(xiàn)狀[J];中國實用眼科雜志;2003年10期

本文編號：2850285