目的耳鳴作為臨床常見病癥,常使患者異常痛苦但尚無理想愈手段。耳鳴發(fā)生與聽覺傳導(dǎo)通路任何一處的興奮性增高相關(guān)。下丘(inferiorcolliculus,IC)作為聽覺傳導(dǎo)通路的重要中繼站,其興奮-抑制失衡是導(dǎo)致耳鳴發(fā)生的重要機制。下丘興奮性谷氨酸能神經(jīng)系統(tǒng)過度興奮或抑制性GABA能神經(jīng)系統(tǒng)興奮性降低,均可通過局部神經(jīng)環(huán)路的放大而產(chǎn)生嚴(yán)重耳鳴。我們研究發(fā)現(xiàn)丹參的有效成分丹參素鈉(SodiumDanshensu,SDSS)具有抑制下丘NMDA受體活性的作用,因而我們推測SDSS能通過抑制NMDA受體起到抑制耳鳴的作用。方法1.電生理實驗制作下丘腦片,藥理學(xué)分離出NMDA受體及GABAA受體,膜片鉗全細胞記錄正常、灌流SS(1mM)以及灌流SS和SDSS(100mM)時NMDA受體電流,記錄正常和灌流SDSS(1OOmM)時NMDA受體、GABAA受體電流。2.體外培養(yǎng)8-11天的下丘神經(jīng)元,分為Control組、SS組、SS+APV組、SS+SDSS 組、NMDA 組、NMDA+APV 組、NMDA+SDSS 組、NMDA+SS 組、NMDA+SS+SDSS組,進行相應(yīng)處理后用hocheast33342染色,計數(shù)細胞凋亡率。收集細胞處理上清液,檢測其中LDH釋放量。3.出生后6～7周聽力正常的C57BL/6雄鼠隨機分為Control組、SS組、SS+SDSS組,每組21只,其中15只用于行為學(xué)實驗,6只用于ABR測聽。SS組使用SS400mg/kg連續(xù)九天腹腔注射制作耳鳴模型,SDSS+SS組中SDSS先于SS前0.5h注射,Control組注射等量生理鹽水。每只小鼠于打藥前后各測一次曠場、高架、強迫游泳實驗評估情緒改變,各測一次ABR聽閾,評估聽力情況。4.將3組實驗后小鼠斷頭處死,取下丘腦組織,并提取蛋白質(zhì),western blotting法分別檢測NR2A-2D4種亞基在膜上的表達以及凋亡執(zhí)行蛋白活化型caspase3的表達。結(jié)果1.對于下丘分離出的NMDA受體電流,灌流SS后幅值增加至對照的139.6±5.5%,而灌流SDSS后幅值減小為對照的67.6±3.59%,同時灌流SS和SDSS時電流幅值為對照的96.5±4.3%,而SDSS對GABAA受體電流幾乎無影響(為對照的98.2±2.9%)。SS增強了 NMDA受體電流,而SDSS抑制NMDA受體電流,并消除SS對NMDA電流增大部分。2.對于體外培養(yǎng)的下丘神經(jīng)元,SS引起的神經(jīng)元死亡增加(凋亡率從8±0.5%到34.6±1.6%,LDH相對于control釋放量為1.3)能被NMDA受體抑制劑APV抑制(凋亡率14.4±0.3%,LDH為1.1),也能被SDSS減輕(凋亡率18.0±1.8%,LDH為1.1),SS通過NMDA受體導(dǎo)致神經(jīng)元的興奮性死亡;SS能夠增強NMDA對下丘神經(jīng)元的興奮毒性(凋亡由41.6±1.2%升到53.1±1.1%,LDH為control 1.7倍),SDSS則明顯抑制SS和NMDA兩者共同對神經(jīng)元的損傷(凋亡從53.1±1.1%降至 17.7±0.7%,LDH 為 1.3)。3.SS耳鳴模型小鼠(n=15)在曠場中央?yún)^(qū)的活動時間(47.1±8.5s)活動距離(429.6±68.8cm)均較實驗前(80.6±7.5s;775.0±68.5cm)明顯減少,進入高架開放臂的次數(shù)(2.3±0.6)和活動時間(10.8±3.8s)較實驗前(6.0±0.9;33.1±6.0s)也顯著減少,在水中的不動時間明顯增加(從100.5±13.3s到138.7±14.5s),表現(xiàn)出明顯的焦慮抑郁情緒。而SDSS+SS組(n=15)小鼠實驗前后在曠場中央?yún)^(qū)、高架開放臂活動情況相似,在水中的不動時間也無明顯差異,SDSS有效消除了耳鳴引發(fā)的焦慮抑郁情緒。4.SDSS抑制了 SS對NR(2A、2B、2D)三種亞基的表達的增加,對活化型caspase3的增加,有效減少了下丘腦組織神經(jīng)元的凋亡。結(jié)論1.SS能夠增強下丘NMDA受體活性,抑制GABA受體活性,破壞下丘興奮抑制平衡,使下丘興奮性顯著升高,是SS引發(fā)耳鳴的重要機制。2.SDSS對下丘NMDA受體活性具有抑制作用,但這種抑制是不完全的。SDSS對GABAA受體活性無影響。3.SDSS可以通過抑制SS引起的NMDA受體過度興奮,緩解小鼠下丘興奮抑制失衡,保護下丘腦組織,而減輕SS引發(fā)的耳鳴及聽力損失。
【學(xué)位單位】：濱州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R764.45
【部分圖文】：

圖１?（ａ、ｂ）?ＳＤＳＳ抑制ＮＭＤＡ受體介導(dǎo)的電流對ＧＡＢＡ受體電流無影響。下丘腦片上藥??理學(xué)分離并記錄ＮＭＤＡ受體、ＧＡＢＡａ受體介導(dǎo)的電流。當(dāng)灌流ＳＤＳＳ后，ＮＭＤＡ受體介導(dǎo)??電流幅值減少（“＊”：?ｐ＜〇．〇５），而ＧＡＢＡａ受體介導(dǎo)電流幅值基本不變，洗脫ＳＤＳＳ后，電流??恢復(fù)正常。（ｃ）?ＳＳ增強下丘ＮＭＤＡ受體介導(dǎo)的電流。下丘腦片上藥理學(xué)分離并記錄ＮＭＤＡ??受體介導(dǎo)的電流，灌流ＳＳ?（ＩｍＭ）后，ＮＭＤＡ誘發(fā)ＮＭＤＡ受體產(chǎn)生電流幅值增加（“＊＊”：??ｐ＜０．０１），洗脫ＳＳ后，電流幅值恢復(fù)正常。（ｄ）?ＳＤＳＳ消除ＳＳ對ＮＭＤＡ電流增大部分。??下丘腦片分離ＮＭＤＡ受體，記錄灌流ＳＤＳＳ后的電流，再同時灌流ＳＳ后，ＮＭＤＡ誘發(fā)ＮＭＤＡ??受體電流無明顯改變。??１８??

探索活動更少，因而進入高架十字迷宮開放臂和曠場中央?yún)^(qū)的活動會明顯減少。我??們發(fā)現(xiàn)，ＳＳ耳鳴模型小鼠實驗后相對實驗前進入高架開放臂（垂直方向）和曠場??中央?yún)^(qū)的活動明顯減少（圖３?ａ、ｄ），統(tǒng)計分析，相對于實驗前進入開放臂的次數(shù)??（６．０±０．９）和時間（３３．１±６．０?ｓ），實驗后明顯減少，分別為２．３±０．６?（ＭＥＡＮ±ＳＥ，??ｎ＝１５，與實驗前比?ｐ＜〇．〇〇ｌ）和?ｌ〇．８±３．８ｓ?（ＭＥＡＮ土ＳＥ，?ｎ＝１５，實驗前比?ｐ＜０．００１）??（圖４ｂ、ｃ）。相對于實驗前進入中央?yún)^(qū)的時間（８０．６±７．５ｓ）和距離（７７５．０±６８．５ｃｍ），??實驗后也明顯減少，分別為４７．１±８．５ｓ?（ＭＥＡＮ±ＳＥ，ｎ＝１５，與實驗前比ｐ＜０．０１）和??４２９．６±６８．８ｃｍ?（ＭＥＡＮ土ＳＥ，ｎ＝１５，與實驗前比ｐ＜０．００１）（圖?３ｅ、ｆ），小鼠表現(xiàn)出??了明顯的焦慮行為。預(yù)先用ＳＤＳＳ保護的小鼠，以及正常對照小鼠，各自實驗前后??進入開放臂和中央?yún)^(qū)的活動情況相似（圖３?ａ、ｄ），進入開放臂次數(shù)和時間，進入??中央?yún)^(qū)時間和距離四個指標(biāo)結(jié)果實驗前后也無統(tǒng)計學(xué)差異（圖３?ｂｅｅｆ）

力受損更為嚴(yán)重為特征［ＩＧ］。為了探宄ＳＤＳＳ是否對ＳＳ耳鳴模型小鼠的聽力也有保??護作用，我們測定了小鼠分別在ｃｌｉｃｋ、８ｋ、１６ｋ、３２ｋ四種刺激聲下的ＡＢＲ閾值。??從ＡＢＲ波形圖中（圖４?ａ、ｂ），?ＳＳ組小鼠閾值明顯增加。而ＳＤＳＳ組實驗前后閾??值相當(dāng)。統(tǒng)計結(jié)果中（圖４ｃ、ｄ），四種聲音下，ＳＳ組小鼠實驗后閾值均顯著增加，??ｃｌｉｃｋ、８ｋ、１６ｋ、３２ｋ?閾值增加分別為?１８．丨±丨?＿７ｄＢ，?２２．２±１．７?ｄＢ，３１．９±丨．９?ｄＢ，?３０．９±１．０??ｄＢ。且高頻聽力損失更嚴(yán)重。而Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＳＤＳＳ各組實驗后閾值升高較小
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本文編號：2844147