研究目的 本研究旨在對(duì)氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變組織差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行初步的研究，為進(jìn)一步研究miRNAs對(duì)視網(wǎng)膜新生血管的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 研究方法 本研究共分四個(gè)部分 第一部分：OIR模型制備。實(shí)驗(yàn)組采用C57BL/6J新生幼鼠，生后第7天飼養(yǎng)在75±2%氧濃度環(huán)境中5天，返回正�？諝猸h(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)5天。對(duì)照組新生幼鼠在正�？諝猸h(huán)境中飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各隨機(jī)選取24個(gè)視網(wǎng)膜組織進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。 第二部分：OIR組織差異表達(dá)miRNAs的篩選。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組隨機(jī)各選10個(gè)視網(wǎng)膜標(biāo)本進(jìn)行混樣，提取樣本的總RNA，采用LC Sciences公司的uParaflo微流體miRNA芯片進(jìn)行高通量篩選。根據(jù)預(yù)設(shè)條件，篩選出miRNAs作為研究對(duì)象進(jìn)行第三部分研究。 第三部分：OIR組織差異表達(dá)miRNAs的初步驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組隨機(jī)各選20個(gè)視網(wǎng)膜標(biāo)本，采用TaqMan qRT-PCR的方法對(duì)篩選出的兩種候選miRNAs進(jìn)行定量研究和驗(yàn)證，比較在兩組間各miRNAs表達(dá)水平的差異是否與芯片結(jié)果一致。 第四部分：對(duì)篩選出差異表達(dá)的miRNA-130a-3p和miRNA-5107-5p進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 第一部分：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組通過(guò)眼球切片觀察玻璃體腔突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目，以及高分子量熒光素灌注法觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)，證實(shí)氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型的成功建立。 第二部分： 1、兩組視網(wǎng)膜樣本均可提取出合格的RNA 分別從實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組視網(wǎng)膜中提取總RNA，采用分光光度法檢測(cè)OD260/280，比值均符合要求。 2、總RNA與miRNA芯片雜交 用實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組提取出的總RNA與miRNA芯片雜交，得到2張成像均勻、清晰的雜交圖像，可證實(shí)總RNA中含有miRNAs。 3、miRNAs在實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中表達(dá)存在差異 采用GenePix pro V6.0軟件，對(duì)探針點(diǎn)的初始熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，然后對(duì)初始強(qiáng)度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，篩選出兩組間差異表達(dá)的miRNAs。以表達(dá)水平變化倍數(shù)R≥2為界，共有31種差異表達(dá)的miRNAs，其中21種在實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組上調(diào),10種下調(diào)。 4、篩選出兩種候選miRNAs 以表達(dá)水平變化倍數(shù)R≥2為界，選擇P值＜0.001以及信號(hào)值大于500，最后篩選出兩種miRNA進(jìn)行第三部分實(shí)驗(yàn)。 第三部分： 1、各視網(wǎng)膜標(biāo)本中均可提取出合格的RNA 兩組視網(wǎng)膜標(biāo)本提取總RNA，OD260/280的比值均符合要求。 2、候選miRNAs的初步驗(yàn)證與篩選 以U6SnRNA為內(nèi)參，對(duì)各miRNAs的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，第二部分實(shí)驗(yàn)中篩選出的miRNA-130a-3p、miRNA-5107-5p在視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)存在顯著性差異，與芯片結(jié)果一致。 第四部分：對(duì)miRNA-130a-3p和miRNA-5107-5p進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)miR-5107-5p靶基因顯著富集于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子,甲狀腺癌通路。miR-130a-3p靶基因顯著富集于甘油脂類(lèi)代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白加工、Notch信號(hào)通路、磷脂酰肌醇信號(hào)通路、甘油磷脂代謝等通路中。 結(jié)論 1、通過(guò)氧誘導(dǎo)方法，可以成功建立OIR模型。 2、芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，某些miRNAs的組織表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組之間存在顯著性差異,本實(shí)驗(yàn)篩選出67種差異表達(dá)的miRNA，其中35種在實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組上調(diào),32種下調(diào)； 3、進(jìn)一步篩選出兩種miRNAs采用TaqMan RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，與芯片結(jié)果一致； 4、對(duì)miRNA-130a-3p和miRNA-5107-5p進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)miR-5107-5p靶基因顯著富集于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子,甲狀腺癌通路。miR-130a-3p靶基因顯著富集于甘油脂類(lèi)代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白加工、Notch信號(hào)通路、磷脂酰肌醇信號(hào)通路、甘油磷脂代謝等通路中。
【學(xué)位單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類(lèi)】：R774.1
【部分圖文】：

圖 1-1 200 倍 圖 1-2圖 1-3 400 倍 圖 1-4 4圖（1）（3）為對(duì)照組視網(wǎng)膜切片，未見(jiàn)突破內(nèi)界膜驗(yàn)組視網(wǎng)膜切片，箭頭處示突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜內(nèi)皮細(xì)2、突破內(nèi)界膜內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目：

圖 2-1 正常對(duì)照組芯片掃描圖 圖 2-2 OIR 組芯片掃描圖3.對(duì)掃描圖像的統(tǒng)計(jì)分析將采集到的熒光數(shù)據(jù)通過(guò) GenePix pro V6.0 軟件整理，得到各探針點(diǎn)熒光強(qiáng)度值。 取每條探針三個(gè)重復(fù)點(diǎn)位的平均值為該探針的熒光強(qiáng)度。背景值即得到信號(hào)均值用來(lái)篩選差異表達(dá)的 miRNAs。表 2-1 差異表達(dá)的 miRNAs名 稱(chēng) P 值 對(duì)照組信號(hào)均值 實(shí)驗(yàn)組信號(hào)均值 差倍miRNA-3962 9.94E-06 74 523 7.miRNA-5121 2.19E-04 630 375 -1miRNA-16-5p 2.89E-04 3193 1802 -1miRNA-130a-3p 4.12E-04 1010 505 -2miRNA-181b-5p 4.42E-04 2011 2846 1.miRNA-let-7j 5.50E-04 344 564 1.miRNA-9-5p 6.24E-04 1044 2181 2.

圖 2-1 正常對(duì)照組芯片掃描圖 圖 2-2 OIR 組芯片掃描圖3.對(duì)掃描圖像的統(tǒng)計(jì)分析將采集到的熒光數(shù)據(jù)通過(guò) GenePix pro V6.0 軟件整理，得到各探針點(diǎn)熒光強(qiáng)度值。 取每條探針三個(gè)重復(fù)點(diǎn)位的平均值為該探針的熒光強(qiáng)度。背景值即得到信號(hào)均值用來(lái)篩選差異表達(dá)的 miRNAs。表 2-1 差異表達(dá)的 miRNAs名 稱(chēng) P 值 對(duì)照組信號(hào)均值 實(shí)驗(yàn)組信號(hào)均值 差倍miRNA-3962 9.94E-06 74 523 7.miRNA-5121 2.19E-04 630 375 -1miRNA-16-5p 2.89E-04 3193 1802 -1miRNA-130a-3p 4.12E-04 1010 505 -2miRNA-181b-5p 4.42E-04 2011 2846 1.miRNA-let-7j 5.50E-04 344 564 1.miRNA-9-5p 6.24E-04 1044 2181 2.

本文編號(hào)：2841734