RNAi抑制CCR3基因?qū)π∈蠓蚀蠹毎挠绊?/H1>
發(fā)布時間：2020-09-19 13:27
目的:構建小鼠CCR3基因慢病毒shRNA載體質(zhì)粒并進行鑒定,利用干擾載體沉默小鼠骨髓源性肥大細胞CCR3基因,進一步研究CCR3基因?qū)π∈蠓蚀蠹毎脑鲋场⒌蛲�、趨化及脫顆粒的影響,建立可能的干預手段尋找到新的分子靶點。方法:1.體外培養(yǎng)并純化小鼠骨髓源性的肥大細胞,用甲苯胺藍染色法及流式細胞儀進行細胞鑒定。2.構建CCR3基因慢病毒shRNA載體:在線設計3條目的基因干擾序列,將其連接到PDSO19-PL RNA干擾慢病毒載體并轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞中,待形成單克隆菌落后進行PCR測序鑒定,測序比對正確的克隆即為所需的CCR3基因RNAi慢病毒載體。3.慢病毒包裝及滴度測定:提取高純度、無內(nèi)毒素的慢病毒shRNA載體及其輔助載體,通過Lipofectamine 2000將兩者共轉(zhuǎn)染到293T細胞,通過換液、培養(yǎng)、離心等處理后獲取上清液,進一步濃縮后獲取高滴度慢病毒濃縮液,并在293T細胞中標定其病毒滴度。4.干擾載體質(zhì)粒對小鼠肥大細胞內(nèi)CCR3基因的沉默檢測:用包裝好的慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠肥大細胞,轉(zhuǎn)染成功后用qRT-PCR方法評價干擾載體對靶基因的沉默效果,選擇最優(yōu)干擾質(zhì)粒。5.用qRT-PCR和Western Bolt檢測各組肥大細胞內(nèi)CCR3基因mRNA及蛋白的表達情況。6.CCK8實驗及流式細胞凋亡檢測各組肥大細胞增殖及凋亡情況。7.Transwell實驗檢測各組肥大細胞的趨化情況。8.Elisa實驗檢測肥大細胞的激活脫顆粒情況。結果:(1)對已構建的3條慢病毒干擾載體進行PCR測序鑒定,DNA序列與CCR3-shRNA1-3寡聚單鏈正鏈序列完全一致,證實CCR3基因干擾載體構建成功。(2)用慢病毒干擾載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后熒光顯微鏡下可見綠色熒光,并在293T細胞中進行病毒包裝,最終可獲取高純度的PDSO19-PL-CCR3慢病毒質(zhì)粒。(3)慢病毒干擾載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠肥大細胞后,經(jīng)qRT-PCR實驗檢測發(fā)現(xiàn)3條shRNA對小鼠肥大細胞CCR3基因均有一定的沉默,其中以shCCR-3-2沉默效率最高。(4)RT-PCR和Western Bolt表明CCR3shRNA能明顯抑制小鼠肥大細胞的CCR3 mRNA和蛋白表達水平,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(5)CCK8及流式細胞凋亡檢測表明CCR3shRNA能夠抑制小鼠肥大細胞的增殖并促進肥大細胞的凋亡,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(6)Transwell檢測表明CCR3shRNA能夠抑制肥大細胞的趨化,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(7)Elisa檢測表明CCR3shRNA能夠抑制肥大細胞的脫顆粒,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:通過RNAi技術,成功構建了小鼠CCR3基因慢病毒shRNA載體質(zhì)粒,其中以CCR3-shRNA2沉默效率最高;CCR3-shRNA2能夠有效的下調(diào)了小鼠肥大細胞CCR3基因mRNA及蛋白水平的表達,同時能夠促進小鼠肥大細胞的凋亡并抑制小鼠肥大細胞的增殖、趨化及脫顆粒,可考慮作為治療過敏性鼻炎的治療靶點。
【學位單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R765.21
【部分圖文】：
小鼠原代肥大細胞光鏡觀察
100× 400×圖 2 小鼠原代肥大細胞甲苯胺藍染色1.3 肥大細胞流式細胞鑒定4 周后收集肥大細胞，應用流式細胞儀檢測細胞表面抗原 CD117 和 FC
肥大細胞表面抗原CD117和FCεRIα表達率 【相似文獻】
相關期刊論文 前10條
1 趙實誠,陸道培;系統(tǒng)性組織肥大細胞病一例報告與文獻復習[J];北京醫(yī)學院學報;1984年03期
2 汝小美;肥大細胞的起源和分化[J];免疫學雜志;1992年03期
3 劉愛華,姜勇;肥大細胞對肺防御功能的調(diào)節(jié)作用[J];第一軍醫(yī)大學學報;2000年03期
4 張文學,張新勝,薛德明,郭玫,張順利,李衛(wèi)國,楊林松;孕鼠子宮肥大細胞分布、數(shù)量和組化性質(zhì)的動態(tài)變化[J];解剖學雜志;2000年03期
5 王濤修,賀明,徐錚,賁長恩;一種顯示肥大細胞的好方法——六胺銀法[J];解剖科學進展;2000年02期
6 賈雪梅,江家元;肥大細胞的異質(zhì)性及其功能意義[J];解剖學雜志;2001年05期
7 王克來;美國科學家發(fā)現(xiàn)肥大細胞有抗菌功能[J];生物技術通報;2002年01期
8 何韶衡,李萍;肥大細胞激活及組織胺水平測定[J];華西醫(yī)科大學學報;2002年04期
9 向梅;呂杰強;朱雪瓊;;肥大細胞局部募集的研究進展[J];醫(yī)學綜述;2006年10期
10 莫雅貞;何韶衡;;天然成分對肥大細胞的影響[J];實用醫(yī)學雜志;2006年17期
相關會議論文 前10條
1 曾躍平;馬東來;;肥大細胞瘤伴“炎焰征”1例[A];2011全國中西醫(yī)結合皮膚性病學術會議論文匯編[C];2011年
2 胡薇薇;徐莉莎;潘杰;陳忠;;全腦缺血再灌注損傷對大鼠腦內(nèi)肥大細胞和組胺的影響[A];第十一屆全國神經(jīng)藥理學術會議論文摘要集[C];2004年
3 毛換偉;雷鵬程;蔡有齡;;兒童肥大細胞瘤1例報告[A];2013全國中西醫(yī)結合皮膚性病學術年會論文匯編[C];2013年
4 辛文文;高姍;康琳;王景林;;基于水母發(fā)光蛋白的肥大細胞傳感器的構建[A];第十一屆中國生物毒素研究及醫(yī)藥應用年會論文摘要集[C];2013年
5 鞠文博;李淑波;周艷;;不同動物肥大細胞光鏡的結構觀察[A];中國解剖學會第十一屆全國組織學與胚胎學青年學術研討會論文匯編[C];2009年
6 賈雪梅;賈友蘇;王惠珠;;大鼠淋巴結內(nèi)肥大細胞免疫組織化學研究[A];解剖學雜志——中國解剖學會2002年年會文摘匯編[C];2002年
7 趙煒;;犬肥大細胞瘤一例[A];2012年中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)病理學分會暨中國病理生理學會動物病理生理專業(yè)委員會學術研討會論文集[C];2012年
8 姚偉;楊洪偉;;機械刺激引起肥大細胞網(wǎng)絡中鈣波傳遞的數(shù)值模擬[A];中國力學大會——2013論文摘要集[C];2013年
9 周衍東;雷紅娟;崔宗杰;;紫外光(UVA)誘導的肥大細胞胞漿鈣振蕩和細胞胞吐[A];第六屆全國光生物學學術研討會論文集[C];2004年
10 周衍東;方曉峰;崔宗杰;;A段紫外線在大鼠肥大細胞誘發(fā)胞漿鈣振蕩[A];第十一次中國生物物理學術大會暨第九屆全國會員代表大會摘要集[C];2009年
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1 李山;肥大細胞處于免疫系統(tǒng)抗病第一線[N];科技日報;2010年
2 ;美國科學家發(fā)現(xiàn)肥大細胞有抗菌功能[N];中國高新技術產(chǎn)業(yè)導報;2001年
3 記者 邱曙東 通訊員 顧海鷹 徐建青;人體肥大細胞成為心臟衛(wèi)士[N];解放日報;2006年
4 記者 黃X;英國研究人員稱一些哮喘患者不宜多用緩解性藥物[N];經(jīng)濟參考報;2010年
5 陳陽;不用抗生素亦能抗感染[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年
6 峻;氣喘成因與呼吸道肌肉有關[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2002年
本文編號：2822559
本文鏈接：http://sikaile.net/yixuelunwen/yank/2822559.html
【學位單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R765.21
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100× 400×圖 2 小鼠原代肥大細胞甲苯胺藍染色1.3 肥大細胞流式細胞鑒定4 周后收集肥大細胞，應用流式細胞儀檢測細胞表面抗原 CD117 和 FC
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6 峻;氣喘成因與呼吸道肌肉有關[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2002年
本文編號：2822559
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