目的:構(gòu)建小鼠CCR3基因慢病毒shRNA載體質(zhì)粒并進(jìn)行鑒定,利用干擾載體沉默小鼠骨髓源性肥大細(xì)胞CCR3基因,進(jìn)一步研究CCR3基因?qū)π∈蠓蚀蠹?xì)胞的增殖、凋亡、趨化及脫顆粒的影響,建立可能的干預(yù)手段尋找到新的分子靶點(diǎn)。方法:1.體外培養(yǎng)并純化小鼠骨髓源性的肥大細(xì)胞,用甲苯胺藍(lán)染色法及流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞鑒定。2.構(gòu)建CCR3基因慢病毒shRNA載體:在線設(shè)計(jì)3條目的基因干擾序列,將其連接到PDSO19-PL RNA干擾慢病毒載體并轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中,待形成單克隆菌落后進(jìn)行PCR測(cè)序鑒定,測(cè)序比對(duì)正確的克隆即為所需的CCR3基因RNAi慢病毒載體。3.慢病毒包裝及滴度測(cè)定:提取高純度、無內(nèi)毒素的慢病毒shRNA載體及其輔助載體,通過Lipofectamine 2000將兩者共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞,通過換液、培養(yǎng)、離心等處理后獲取上清液,進(jìn)一步濃縮后獲取高滴度慢病毒濃縮液,并在293T細(xì)胞中標(biāo)定其病毒滴度。4.干擾載體質(zhì)粒對(duì)小鼠肥大細(xì)胞內(nèi)CCR3基因的沉默檢測(cè):用包裝好的慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠肥大細(xì)胞,轉(zhuǎn)染成功后用qRT-PCR方法評(píng)價(jià)干擾載體對(duì)靶基因的沉默效果,選擇最優(yōu)干擾質(zhì)粒。5.用qRT-PCR和Western Bolt檢測(cè)各組肥大細(xì)胞內(nèi)CCR3基因mRNA及蛋白的表達(dá)情況。6.CCK8實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)各組肥大細(xì)胞增殖及凋亡情況。7.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組肥大細(xì)胞的趨化情況。8.Elisa實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肥大細(xì)胞的激活脫顆粒情況。結(jié)果:(1)對(duì)已構(gòu)建的3條慢病毒干擾載體進(jìn)行PCR測(cè)序鑒定,DNA序列與CCR3-shRNA1-3寡聚單鏈正鏈序列完全一致,證實(shí)CCR3基因干擾載體構(gòu)建成功。(2)用慢病毒干擾載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后熒光顯微鏡下可見綠色熒光,并在293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝,最終可獲取高純度的PDSO19-PL-CCR3慢病毒質(zhì)粒。(3)慢病毒干擾載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠肥大細(xì)胞后,經(jīng)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)3條shRNA對(duì)小鼠肥大細(xì)胞CCR3基因均有一定的沉默,其中以shCCR-3-2沉默效率最高。(4)RT-PCR和Western Bolt表明CCR3shRNA能明顯抑制小鼠肥大細(xì)胞的CCR3 mRNA和蛋白表達(dá)水平,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(5)CCK8及流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)表明CCR3shRNA能夠抑制小鼠肥大細(xì)胞的增殖并促進(jìn)肥大細(xì)胞的凋亡,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(6)Transwell檢測(cè)表明CCR3shRNA能夠抑制肥大細(xì)胞的趨化,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(7)Elisa檢測(cè)表明CCR3shRNA能夠抑制肥大細(xì)胞的脫顆粒,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:通過RNAi技術(shù),成功構(gòu)建了小鼠CCR3基因慢病毒shRNA載體質(zhì)粒,其中以CCR3-shRNA2沉默效率最高;CCR3-shRNA2能夠有效的下調(diào)了小鼠肥大細(xì)胞CCR3基因mRNA及蛋白水平的表達(dá),同時(shí)能夠促進(jìn)小鼠肥大細(xì)胞的凋亡并抑制小鼠肥大細(xì)胞的增殖、趨化及脫顆粒,可考慮作為治療過敏性鼻炎的治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R765.21
【部分圖文】：

小鼠原代肥大細(xì)胞光鏡觀察

100× 400×圖 2 小鼠原代肥大細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色1.3 肥大細(xì)胞流式細(xì)胞鑒定4 周后收集肥大細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原 CD117 和 FC

肥大細(xì)胞表面抗原CD117和FCεRIα表達(dá)率

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