研究背景糖尿病性白內(nèi)障(diabetic cataract,DC)是糖尿病病人中發(fā)生較早的眼部并發(fā)癥,是致盲的主要原因之一。糖尿病患者的年齡相關(guān)性白內(nèi)障具有發(fā)病年齡早、晶狀體混濁進展快以及容易成熟的特點。手術(shù)是白內(nèi)障有效的治療方式,盡管當前手術(shù)設(shè)備和技術(shù)都有很大的發(fā)展和提高,但糖尿病患者的手術(shù)并發(fā)癥的發(fā)生率較高。隨著糖尿病發(fā)病率不斷增加,DC引起越來越多的重視,但其發(fā)病機制尚不明確。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮細胞失去其正常分化表型,轉(zhuǎn)化成為間質(zhì)細胞的過程。目前研究認為,晶狀體上皮細胞發(fā)生EMT和白內(nèi)障的發(fā)病關(guān)系密切。自噬(autophagy)是細胞清除自身異常蛋白質(zhì)和細胞器,以及回收利用營養(yǎng)物質(zhì)的重要途徑,對于維持細胞生存和發(fā)育極為重要。晶狀體上皮細胞通過自噬-溶酶體途徑可以清除細胞內(nèi)累積的晶體蛋白和分化過程中的細胞器,維持細胞的正常形態(tài)和分化功能,這也是維持晶狀體透明的重要手段。研究發(fā)現(xiàn),自噬功能異常參與了多種白內(nèi)障的發(fā)病過程。microRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性的非編碼小RNAs,長度約22個核苷酸。miRNAs通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的方式,在多個組織內(nèi)對EMT和自噬相關(guān)通路發(fā)揮重要作用。因此,miRNAs對EMT和自噬的調(diào)控作用成為研究的新視角,同時miRNAs也成為治療EMT和自噬失調(diào)疾病的潛在分子。研究發(fā)現(xiàn),miRNAs與糖尿病性角膜病、原發(fā)性閉角型青光眼、視網(wǎng)膜疾病及白內(nèi)障等眼部疾病的發(fā)生關(guān)系密切。但是,miRNAs在糖尿病性白內(nèi)障中對EMT和自噬的調(diào)控機制尚無報道。通過miRNA芯片技術(shù)(miRNA microarray)可以篩選出正常晶狀體和DC組織間差異表達的miRNAs,并對異常表達的miRNAs進行生物信息學(xué)預(yù)測和功能研究,有助于發(fā)現(xiàn)DC的發(fā)病機制。研究目的本研究運用DC晶狀體上皮細胞的miRNAs表達譜和體外高糖模型,研究miR-30a對晶狀體上皮細胞的EMT和自噬的調(diào)控機制,探討其在DC發(fā)病過程中的作用。研究方法1.利用miRNA芯片技術(shù),建立正常晶狀體和DC晶狀體上皮細胞的miRNAs表達譜,篩選差異表達的miRNAs(miR-30a),并進行實時熒光定量PCR驗證。2.根據(jù)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫miRNA預(yù)測網(wǎng)站,預(yù)測miR-30a的靶基因,篩選其中與EMT和自噬相關(guān)的基因,進行雙熒光素酶報告基因檢測,明確miR-30a與預(yù)測靶基因的關(guān)系。3.運用免疫組織化學(xué)染色和Western blotting技術(shù),檢測上皮細胞標志物(E-cadherin)和EMT晚期標記物(vimentin和α-SMA)的表達;使用透射電鏡技術(shù)觀察自噬小體的形態(tài)。4.建立體外高糖模型,包括晶狀體囊袋體外培養(yǎng)高糖模型和晶狀體上皮細胞(HLECs-B3)高糖模型,從而模擬晶狀體上皮細胞在體內(nèi)的高糖狀態(tài)。5.在體外高糖模型中,通過轉(zhuǎn)染miR-30a模擬物和抑制物調(diào)節(jié)miR-30a的表達,進而達到調(diào)控EMT和自噬的目的。利用Western blotting和實時熒光定量PCR檢測靶基因(SNAI1和BECN1)、EMT晚期標記物(vimentin和α-SMA)和自噬標記物(LC3BI和LC3BII)的蛋白和mRNA表達量;流式細胞儀檢測晶狀體上皮細胞的細胞凋亡率。研究結(jié)果第一部分miR-30a靶向結(jié)合SNAI1基因調(diào)控晶狀體上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化1.1糖尿病性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞中EMT和miR-30a的表達變化(1)通過免疫組織化學(xué)染色和Western blotting發(fā)現(xiàn),與正常晶狀體相比,DC晶狀體上皮細胞的E-cadherin蛋白表達下降,而vimentin和α-SMA的蛋白表達則增高。(2)miRNA芯片結(jié)果顯示,與正常晶狀體上皮細胞相比,DC晶狀體上皮細胞中有73個miRNAs表達增高2倍以上,199個miRNAs表達下降超過兩倍,其中miR-30a表達下降約180倍。實時熒光定量PCR結(jié)果也驗證了 miR-30a在DC晶狀體上皮細胞中表達明顯下降。1.2體外高糖模型的晶狀體上皮細胞中EMT和miR-30a的表達變化(1)免疫組織化學(xué)染色顯示,高糖刺激可以晶狀體上皮細胞中的vimentin和α-SMA表達增高。(2)實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,體外高糖環(huán)境下,晶狀體上皮細胞的miR-30a表達明顯下降。由此可見,我們建立的晶狀體囊袋體外培養(yǎng)高糖模型可以充分模擬DC晶狀體上皮細胞在體內(nèi)的狀態(tài)。1.3 SNAI1基因是miR-30a的靶基因(1)通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫miRNA預(yù)測網(wǎng)站(TargetScanHuman,http://www.targetscan.org/),預(yù)測 miR-30a 可以靶向結(jié)合于 SNAI1 的 3'UTR(706-713)。(2)雙熒光素酶報告基因檢測顯示,當pmiR-RB-REPORT-SNAIl-3'UTR和miR-30amimic(模擬物)共表達時,熒光素酶活性明顯下降;將SNAI1 3'UTR的結(jié)合位點突變,解除了 miR-30a對SNAI1的負性調(diào)控作用,熒光素酶活性增強。因此,研究表明SNAI1是miR-30a的靶基因。(3)晶狀體囊袋體外培養(yǎng)高糖模型中,miR-30a可以直接調(diào)控SNAI1的表達。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,miR-30amimic組中SNAI1的mRNA表達明顯下降(mimic NC 作為對照,P0.05);miR-30a inhibitor(抑制物)組中 SNAI1的 mRNA 表達明顯增多(inhibitor NC 作為對照,P0.05)。Western blotting 結(jié)果顯示,miR-30amimic組中SNAI1的蛋白表達明顯下降(mimicNC作為對照,P0.05);miR-30a inhibitor 組中 SNAI1 的蛋白表達明顯增多(inhibitor NC 作為對照,P0.05)。1.4 miR-30a通過SNAI1基因負性調(diào)控EMT(1)Western blotting結(jié)果顯示,miR-30a mimic可抑制高糖誘導(dǎo)的EMT晚期標記物vimentin和α-SMA的蛋白表達(mimic NC作為對照,P0.05)。(2)miR-30a mimic 可抑制 TGF-β 2 誘導(dǎo)的高 EMT 水平。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),加入TGF-β 2后vimentin和a-SMA的蛋白表達明顯增高,說明高糖環(huán)境下TGF-β 2可誘導(dǎo)晶狀體上皮細胞發(fā)生EMT;同時加入TGF-β 2和miR-30a mimic后,vimentin和α-SMA蛋白表達下降,EMT受到抑制。第二部分miR-30a靶向結(jié)合BECN1基因調(diào)控晶狀體上皮細胞的自噬1.1糖尿病性白內(nèi)障組織中miR-30a表達下降miRNA芯片結(jié)果顯示,與正常晶狀體上皮細胞相比,DC晶狀體上皮細胞中miRNAs表達上調(diào)幅度最大的前5個miRNAs分別是miR-431-5p、miR-3169、miR-371a-3p、miR-1537和miR-593-3p,表達下調(diào)幅度最大的前5位分別是miR-30a-5p,miR-193a-3p,miR-204-5p,miR-184 和 miR-29b-3p。實時熒光定量PCR進行驗證,結(jié)果與miRNA芯片一致,DC晶狀體上皮細胞中miR-30a的表達明顯下降。1.2糖尿病性白內(nèi)障組織中自噬變化透射電鏡結(jié)果顯示,人DC晶狀體上皮細胞中自噬小體體積增大,且單個自噬小體中包含多個待降解的線粒體。1.3 BECN1是miR-30a的靶基因(1)生物信息數(shù)據(jù)庫(TargetScanHuman,http://www.targetscan.org/)預(yù)測,miR-30a可直接與BECN1的3'UTR(240-247)靶向結(jié)合。(2)雙熒光素酶報告基因檢測,當pmiR-RB-REPORT-BECN1 3'UTR和miR-30aagomir(模擬物)共表達時,熒光素酶活性明顯下降;將BECN1 3'UTR的結(jié)合位點突變,可以解除miR-30a對BECN1的負性調(diào)控作用,熒光素酶活性增強。因此,研究表明BECN1是miR-30a的靶基因。(3)高糖培養(yǎng)環(huán)境下,miR-30a agomir可降低晶狀體上皮細胞(HLECss-B3)中BECN1的蛋白表達量(agomirNC作為陰性對照,P0.05);相反,miR-30a antagomir(抑制物)可導(dǎo)致BECN1蛋白表達增高(antagomirNC作為陰性對照,P0.05)。1.4 miR-30a可抑制高糖誘導(dǎo)的晶狀體上皮細胞的自噬(1)高糖通過BECN1依賴途徑誘導(dǎo)晶狀體上皮細胞的自噬。LC3B是最重要的自噬標記物,LC3BD/LC3BI比值增大代表自噬小體形成增多,比值下降則代表自噬小體形成受損。高糖培養(yǎng)環(huán)境下晶狀體上皮細胞中的LC3BII/LC3BI比值明顯增大;加入BECNlsiRNA后,LC3BII/LC3BI比值下降。(2)miR-30a可抑制高糖誘導(dǎo)的自噬。轉(zhuǎn)染miR-30a agomir后,LC3BII/LC3BIL比值明顯下降(agomir NC作為對照組,P0.05);同時,LC3B的mRNA的表達也是下降(agomirNC作為對照組,P0.05)。1.5 miR-30a可抑制晶狀體上皮細胞的凋亡。高糖培養(yǎng)環(huán)境下晶狀體上皮細胞的凋亡增多,加入miR-30a agomir后發(fā)生凋亡的細胞減少(agomir NC作為對照組,P0.05)。結(jié)論1.正常晶狀體和糖尿病性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞中的miRNAs表達存在差異,其中miR-30a表達下降約180倍。2.晶狀體囊袋體外培養(yǎng)高糖模型中,miR-30a通過靶向結(jié)合SNAI1基因,抑制晶狀體上皮細胞EMT的發(fā)生。3.高糖培養(yǎng)環(huán)境下,miR-30a通過靶向結(jié)合BECN1基因,抑制晶狀體上皮細胞的自噬。4.miR-30a可以抑制高糖誘導(dǎo)的晶狀體上皮細胞的凋亡,對晶狀體上皮細胞起保護作用。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R776.1;R587.2
【部分圖文】：

圖１．晶狀體的發(fā)育［３５］。逡逑胚胎２２天，在前腦神經(jīng)褶的區(qū)域，形成眼球的最初形態(tài)即視溝和視窩。２４逡逑天時視窩逐漸變深形成囊狀凸起，稱為視泡。２８天視泡的遠端面向表皮外胚層逡逑方向接近，并在胚胎３２天時發(fā)生接觸，此時外胚層細胞增厚形成晶狀體板。３３逡逑天晶狀體板從表皮外胚層分離，逐漸形成一個中空的晶狀體泡，晶狀體泡的前表逡逑面（ａｎｔｅｒｉｏｒｆａｃｅ）由一層立方上皮細胞組成，其后發(fā)育成前囊膜下的晶狀體上皮逡逑細胞；與此同時視泡的遠端面凹陷形成視杯，新形成的晶狀體泡剛好位于視杯中；逡逑隨后，呈凝膠狀的原始玻璃體被分泌到晶狀體泡和視杯間隙內(nèi)；隨著晶狀體泡的逡逑發(fā)育，其逐漸被一層間充質(zhì)囊包繞，稱為晶狀體囊膜，其前面是瞳孔膜。３３天逡逑開始，從晶狀體泡后壁的細胞分化成前后走向的細長柱狀細胞，形成晶狀體泡的逡逑后壁（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ邋ｆａｃｅ），在此過程中細胞核逐漸被降解；這些細胞也不斷延長，形逡逑成高度透明的初級晶狀體纖維細胞（ｐｒｉｍａｒｙ邋ｌｅｎｓ邋ｆｉｂｅｒｓ）。在胚胎７周后期初級晶逡逑狀體纖維細胞逐漸填充并消除晶狀體泡的空腔；位于晶狀體前后極之間的晶狀體逡逑邊緣部被稱為赤道區(qū)或赤道部，赤道部的細胞呈立方形，隨著這些細胞的延長和逡逑細丟失，成為次級晶狀體纖維細胞（ｓｅｃｏｎｄａｒｌｅｎｓ邋ｆｉｂｅｒｓ），次級晶狀體纖逡逑

邐山東大學(xué)博士學(xué)位論文過Ｓｍａｄ和非Ｓｍａｄ途徑誘導(dǎo)ＥＭＴ的發(fā)生［７９］。其中，Ｓｍａｄ信號可以通過調(diào)Ｓｎａｉｌ／Ｓｌｕｇ、ＺＥＢ１／２和Ｔｗｉｓｔ三個家族的轉(zhuǎn)錄因子，進而抑制上皮細胞標記物表達。ＴＧＦ－０有三個同源異構(gòu)體０邋１、０邋２和０邋３，其中３邋２在眼組織中高度表達，逡逑可以引起晶狀體細胞增殖、分化和凋亡異常，從而引起白內(nèi)障［８０］。磷脂酰肌３激酶（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ３－ｋｉｎａｓｅ，邋ＰＩ３Ｋ）是ＴＧＦ－Ｐ下游的信號分子，參與調(diào)細胞的分裂、分化和調(diào)亡。蛋白激酶Ｂ邋（ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｋｉｎａｓｅ邋Ｂ，ＰＫＢ）也稱為Ａｋｔ，逡逑可由ＰＩ３Ｋ激活，調(diào)控細胞生存。細胞在高糖環(huán)境下釋放活性氧簇（ｒｅａｃｔｉｖｅ邋ｏｘｙｇｅｓｐｅｃｉｅｓ，邋ＲＯＳ），激活邋ＴＧＦ－０邋２／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ邋信號途徑，誘導(dǎo)細胞發(fā)生邋ＥＭＴ［８１，８２］。逡逑在晶狀體上皮細胞中，ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ途徑在ＴＧＦ－邋０邋２誘導(dǎo)的ＥＭＴ過程中起重要作［８３，邋８４］。高糖可以激活ＬＥＣｓ中的ＡＲ活性，引起細胞發(fā)生氧化應(yīng)激，細胞ＡＧＥ堆積；同時也激活ＴＧＦ－０邋２／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信號途徑，誘導(dǎo)ＥＭＴ的發(fā)生［７１］。逡逑ＡＧＥ也可以通過ＴＧＦ－０邋２誘導(dǎo)ＥＭＴ的發(fā)生，參與后發(fā)性白內(nèi)障的形成［７５］。逡逑

山東大學(xué)博士學(xué)位論文噬溶酶體、以及溶酶體將內(nèi)容物降解。當ＵＬＫ１復(fù)合體（包括ＵＬＫ１激酶和逡逑物、Ａｔｇｌ３和ＦＩＰ２０００）被腺嘌呤核糖核苷酸活化蛋白質(zhì)激酶（ａｄｏｒｏｓｍｅｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｋｉｎａｓｅ，ＡＭＰＫ）激活或被哺乳動物雷帕霉素耙蛋逡逑質(zhì)（ｍａｍｍａｌｉａｎ邋ｔａｒｇｅｔ邋ｏｆ邋ｒａｐａｍｙｃｉｎ，ｍＴＯＲ）復(fù)合體邋１邋（ｍＴＯＲＣｌ）抑制時，逡逑以啟動自嗤（Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）；自嗤小體形成的前期階段（Ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ），主要由Ｂｅｃｌｉｎｌ逡逑（即ＢＥＣＮ１）－Ｖｓｐ３４－Ａｔｇｌ４復(fù)合體介導(dǎo)完成；在自噻小體膜不斷延長、成囊，微管相關(guān)蛋白邋１邋輕鏈邋３邋（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋１邋ｌｉｇｈｔ邋ｃｈａｉｎ邋３，ＬＣ３）被Ａｔｇ活化，與ＰＥ分子結(jié)合形成ＬＣ３ＩＩ，ＬＣ３ＩＩ則可與自噬小體的囊膜結(jié)合；逡逑后ＬＣ３ＩＩ通過與銜接蛋白ｐ６２結(jié)合，介導(dǎo)自噬小體與溶酶體融合［８７，邋８８］。＿逡逑

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 Chang-Rui Wu;Min Ye;Li Qin;Yue Yin;Cheng Pei;;Expression of lens-related microRNAs in transparent infant lenses and congenital cataract[J];International Journal of Ophthalmology;2017年03期

2 Ying Sun;Chun-Mei Lu;Zhen Song;Ke-Ke Xu;Shu-Bin Wu;Zhi-Jian Li;;Expression and regulation of microRNA-29a and microRNA-29c in early diabetic rat cataract formation[J];International Journal of Ophthalmology;2016年12期

3 Qing-Lan Li;Hong-Yang Zhang;Yong-Jie Qin;Qian-Li Meng;Xiao-Lei Yao;Hai-Ke Guo;;MicroRNA-34a promoting apoptosis of human lens epithelial cells through down-regulation of B-cell lymphoma-2 and silent information regulator[J];International Journal of Ophthalmology;2016年11期

本文編號：2814074