第一部分 PARP-1介導(dǎo)的AIF轉(zhuǎn)位參與鏈霉素導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞損傷的機(jī)制研究研究目的:氨基糖苷類藥物導(dǎo)致的毛細(xì)胞損傷是感音神經(jīng)性聽力損失研究的重要內(nèi)容。以鏈霉素為代表的耳毒性藥物在臨床上仍然有著重要的應(yīng)用。目前藥物性毛細(xì)胞損傷的確切機(jī)制尚未完全闡明,傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為其是由含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspases)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程,但是也有觀點(diǎn)認(rèn)為非Caspases依賴的程序性細(xì)胞死亡通路也在其中起著重要的作用。本研究希望通過建立耳蝸毛細(xì)胞鏈霉素?fù)p傷模型,探討一種重要的線粒體來源的細(xì)胞死亡調(diào)控因子——凋亡誘導(dǎo)因子(AIF),在毛細(xì)胞死亡過程中的作用并明確其調(diào)控機(jī)制,完善鏈霉素相關(guān)聽力損失的防治理論基礎(chǔ)并尋求新的治療靶點(diǎn)。研究方法:體外原代培養(yǎng)乳大鼠耳蝸基底膜毛細(xì)胞和連續(xù)培養(yǎng)HEI-OC1細(xì)胞,加入硫酸鏈霉素(以下簡稱鏈霉素)建立毛細(xì)胞體外損傷模型,加入鏈霉素和PARP-1抑制劑3-AB建立毛細(xì)胞保護(hù)模型。通過Myosin Ⅶla免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡觀察毛細(xì)胞,確定鏈霉素處理24h后基底膜毛細(xì)胞的數(shù)目及形態(tài)并選擇合適濃度的鏈霉素進(jìn)行后續(xù)處理;MTT法檢測HEI-OC1細(xì)胞鏈霉素處理后的相對存活率以確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)鏈霉素濃度,檢測3-AB(1 mM)對毛細(xì)胞損傷的保護(hù)作用;免疫熒光染色結(jié)合共聚焦顯微鏡觀察毛細(xì)胞內(nèi)AIF核轉(zhuǎn)位和PARP-1的激活情況;利用線粒體分離技術(shù)和Western-blot分析AIF在細(xì)胞內(nèi)線粒體和細(xì)胞質(zhì)中的含量改變;qRT-PCR和Western-blot檢測HEI-OC1細(xì)胞內(nèi)PARP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。研究結(jié)果:與對照組相比,不同濃度鏈霉素(1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml)處理24h后基底膜均出現(xiàn)萎縮,Myosin Ⅶa免疫熒光顯示毛細(xì)胞不同程度的減少、排列紊亂。鏈霉素濃度越高,毛細(xì)胞損傷越嚴(yán)重。相同鏈霉素處理濃度下,毛細(xì)胞損傷從頂回向底回逐漸加重,其中內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞損傷程度類似。MTT結(jié)果顯示鏈霉素導(dǎo)致的HEI-OC1細(xì)胞損傷同樣隨濃度增加而加重。鏈霉素(2mg/ml)處理耳蝸基底膜后,殘留毛細(xì)胞細(xì)胞核中既有萎縮表現(xiàn),也有腫脹表現(xiàn)。對照組基底膜毛細(xì)胞免疫熒光染色顯示AIF僅出現(xiàn)在細(xì)胞漿區(qū)域,細(xì)胞核區(qū)域無染色,而鏈霉素處理后,毛細(xì)胞AIF染色增強(qiáng),并且細(xì)胞核區(qū)域出現(xiàn)了明顯染色。HEI-OC1細(xì)胞中,免疫熒光顯示鏈霉素(5mg/ml)處理后AIF散在出現(xiàn)在細(xì)胞核中,Western-blot顯示鏈霉素處理后細(xì)胞線粒體內(nèi)AIF表達(dá)降低,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)量升高。免疫熒光顯示對照組基底膜毛細(xì)胞和HEI-OC1細(xì)胞均未見明顯PARP-1染色,鏈霉素處理后細(xì)胞核出現(xiàn)了 PARP-1強(qiáng)染色。qRT-PCR顯示鏈霉素處理后HEI-OC1細(xì)胞PARP-1 mRNA表達(dá)明顯升高,Western-blot顯示PARP-1蛋白表達(dá)明顯升高。加入3-AB后,MTT檢測顯示鏈霉素造成的HEI-OC1細(xì)胞損傷減輕,而且Western-blot結(jié)果也顯示鏈霉素造成的AIF線粒體中蛋白表達(dá)降低而細(xì)胞質(zhì)中升高的趨勢消失。研究結(jié)論:鏈霉素可以導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞濃度和位置依賴性的損傷;鏈霉素?fù)p傷毛細(xì)胞過程中AIF從線粒體轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì);AIF的轉(zhuǎn)位過程受PARP-1調(diào)控。第二部分內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸在聯(lián)合應(yīng)用鏈霉素和速尿?qū)е碌拇笫舐犃p失中的改變研究目的:目前氨基糖苷類抗生素耳毒性的研究多集中在其如何損傷耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等,還沒有文章探討聽覺傳導(dǎo)通路中第一個(gè)信號傳遞點(diǎn)——帶狀突觸,在急性藥物性耳聾中的改變。耳蝸中帶狀突觸是一種特化的突觸連接,位于毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之間,對聲音信號快速、持續(xù)而準(zhǔn)確的傳遞有著重要的作用。目前研究認(rèn)為,帶狀突觸可能是聽覺通路中最脆弱的部分。我們希望通過速尿和鏈霉素聯(lián)合應(yīng)用構(gòu)建大鼠急性聽力損失模型,探討藥物作用下內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸的改變。研究方法:大鼠同時(shí)分別腹腔注射速尿(200m/kg)和肌肉注射硫酸鏈霉素(200mg/kg)以構(gòu)建大鼠急性聽力損失模型。聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢測大鼠各頻率的聽閾;CtBP2、GluR23、Myosin Ⅶa以及Tuj-1免疫熒光染色分別標(biāo)記突觸前部分、突觸后部分、毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞并進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析。研究結(jié)果:ABR顯示大鼠同時(shí)注射速尿和鏈霉素后1 d即出現(xiàn)全頻的聽力損失,且1月后仍不能恢復(fù)。與對照組相比,藥物處理后大鼠基底膜毛細(xì)胞CtBP2染色顯示帶狀突觸數(shù)目明顯減少,呈自頂回向底回逐漸加重的趨勢,且其損失程度比內(nèi)毛細(xì)胞減少程度更嚴(yán)重。藥物處理后殘留的部分突觸出現(xiàn)腫脹、位置移動等異常表現(xiàn),且與數(shù)目減少程度呈正相關(guān)。CtBP2和Glu R23標(biāo)記的突觸前后部分在藥物處理10 d后明顯分離。藥物處理10 d后螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞無明顯改變,但是1月后其胞體和神經(jīng)纖維明顯減少,且以頂回和中回為甚。研究結(jié)論:速尿和鏈霉素聯(lián)合應(yīng)用可以引起大鼠不可逆的全頻聽力損失;速尿和鏈霉素引起的早期聽力損失可能由帶狀突觸損傷引起。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R764
【部分圖文】：

圖２．內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸模式圖逡逑考文獻(xiàn)（Ｌｉｂｅｒｍａｎ邋Ｍ邋Ｃ．邋Ｎｏｉｓｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ａｎｄ邋ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ邋ｈｅａｒｉｓ邋ａｎｄ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ邋ｔｈｅｒａｐｉｅｓ［Ｊ］．邋ＦＩＯＯＯＲｅｓ，邋２０１７，邋６：邋９２７）邋［４５］0逡逑聽力損失與帶狀突觸逡逑宄認(rèn)為，帶狀突觸的損傷在噪音性聽力損失中可能起到強(qiáng)度聲音暴露后可以產(chǎn)生暫時(shí)性的聽力閾移。對小鼠進(jìn)，短期內(nèi)毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞沒有發(fā)生明顯改變，�。蟹迪陆担挥|數(shù)目明顯減少，形態(tài)異常，脫離噪聲環(huán)恢復(fù)正常，但是ＣＡＰ幅值和突觸數(shù)目并未完全恢復(fù)，而旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞也會出現(xiàn)損失［４６；４８；４９］。此外，Ｓｈｉ等對豚鼠傷的突觸可以部分修復(fù)，但是再生的突觸在時(shí)相處理等功考慮到低強(qiáng)度噪音在現(xiàn)代生活中相對較多的接觸機(jī)會，可能逐累，導(dǎo)，

時(shí)基底膜也出現(xiàn)了不同程度的萎縮。不同位置的毛細(xì)胞對于鏈霉素的反應(yīng)也不同。逡逑相同濃度下，底回毛細(xì)胞對于鏈霉素最敏感，損傷最重，中回次之，頂回則無明逡逑顯變化（圖１）。逡逑隨著鏈霉素濃度的升高，毛細(xì)胞缺失比例也逐漸嚴(yán)重。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，鏈逡逑霉素濃度越高，內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞的損傷程度越重。除頂回外，ｌｍｇ／ｍｌ鏈霉逡逑素即可引起內(nèi)毛細(xì)胞明顯缺失，２ｍｇ／ｍｌ及更高濃度鏈霉素可引起外毛細(xì)胞明顯缺逡逑失（Ｐ＜０．０５）。相同位置和相同濃度鏈霉素作用下，內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞的缺失逡逑情況則無明顯差異（辦0．0５）（圖１）。逡逑根據(jù)以上結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中損傷基底膜時(shí)使用的鏈霉素濃度被確定為逡逑２ｍｇ／ｍｌ0逡逑１．２鏈霉素對于ＨＥ卜０Ｃ１細(xì)胞的損傷逡逑本研宄通過ＭＴＴ法檢測不同濃度的鏈霉素對于連續(xù)培養(yǎng)的ＨＥＩ－ＯＣ１細(xì)胞的逡逑損傷作用。試驗(yàn)中選取了邋１邋ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１邋Ｏｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、逡逑３０ｍｇ／ｍｌ和４０ｍｇ／ｍｌ共計(jì)８個(gè)不同濃度。以１５ｍｇ／ｍｌ鏈霉素為例，藥物處理２４ｈ逡逑后可以看到ＨＥＩ－０Ｃ１細(xì)胞數(shù)目明顯減少，胞體明顯萎縮，細(xì)胞核皺縮，形成空逡逑泡樣的外觀

逑相比明顯下降（戶＜０．０５），５ｍｇ／ｍｌ鏈霉素存活率降至７８．３３±２．４０％，１５ｍｇ／ｍｌ鏈逡逑霉素存活率降至４５．１５６士８．００％邋（圖２Ｂ）。逡逑根據(jù)以上結(jié)果，考慮到藥物損傷是逐漸進(jìn)展的過程，５ｍｇ／ｍｌ濃度的鏈霉素逡逑己可引起相應(yīng)的基因及蛋白改變，更高濃度的鏈霉素的損傷較重，可能引起其他逡逑細(xì)胞死亡相關(guān)通路的改變，本實(shí)驗(yàn)后續(xù)損傷ＨＥＩ－ＯＣ１細(xì)胞的鏈霉素濃度被確定逡逑為邋５ｍｇ／ｍｌ0逡逑Ａｐｅｘ邐Ｍｉｄ邐Ｂａｓｅ逡逑Ｏｍｏｍｌ逡逑一逡逑ｓ邋｜Ｍ邐ＩＮ邐Ｏ邐ｎ0Ｈｒ逡逑＂ｃ邋ｌｏｏｊ邋Ｔｉ—■邐ｌ0？－｜邋Ｔ邋Ｔ邐ｌ，Ｍ，－邋Ｔ邋＊ｒ邐ＣＱＩＨＣ逡逑＿Ｐ邋＿邋Ｓ?jì)p說邐媝ｉ邐■．逡逑：ｉＭｊｍ丨W＿，邋＿邋＿丨X櫻呶義希埃恚簀澹恚戾澹歟恚玨澹恚戾澹玻恚輳ǎ恚戾澹擔(dān)恚澹恚戾危希恚鑠澹恚戾澹桑恚輳螅В恚戾澹玻恚隋澹恚戾澹擔(dān)恚椋翦澹恚戾

本文編號：2809132