第一部分 PARP-1介導的AIF轉位參與鏈霉素導致耳蝸毛細胞損傷的機制研究研究目的:氨基糖苷類藥物導致的毛細胞損傷是感音神經性聽力損失研究的重要內容。以鏈霉素為代表的耳毒性藥物在臨床上仍然有著重要的應用。目前藥物性毛細胞損傷的確切機制尚未完全闡明,傳統(tǒng)觀點認為其是由含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspases)介導的細胞凋亡過程,但是也有觀點認為非Caspases依賴的程序性細胞死亡通路也在其中起著重要的作用。本研究希望通過建立耳蝸毛細胞鏈霉素損傷模型,探討一種重要的線粒體來源的細胞死亡調控因子——凋亡誘導因子(AIF),在毛細胞死亡過程中的作用并明確其調控機制,完善鏈霉素相關聽力損失的防治理論基礎并尋求新的治療靶點。研究方法:體外原代培養(yǎng)乳大鼠耳蝸基底膜毛細胞和連續(xù)培養(yǎng)HEI-OC1細胞,加入硫酸鏈霉素(以下簡稱鏈霉素)建立毛細胞體外損傷模型,加入鏈霉素和PARP-1抑制劑3-AB建立毛細胞保護模型。通過Myosin Ⅶla免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡觀察毛細胞,確定鏈霉素處理24h后基底膜毛細胞的數目及形態(tài)并選擇合適濃度的鏈霉素進行后續(xù)處理;MTT法檢測HEI-OC1細胞鏈霉素處理后的相對存活率以確定后續(xù)實驗鏈霉素濃度,檢測3-AB(1 mM)對毛細胞損傷的保護作用;免疫熒光染色結合共聚焦顯微鏡觀察毛細胞內AIF核轉位和PARP-1的激活情況;利用線粒體分離技術和Western-blot分析AIF在細胞內線粒體和細胞質中的含量改變;qRT-PCR和Western-blot檢測HEI-OC1細胞內PARP-1 mRNA和蛋白的表達情況。研究結果:與對照組相比,不同濃度鏈霉素(1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml)處理24h后基底膜均出現萎縮,Myosin Ⅶa免疫熒光顯示毛細胞不同程度的減少、排列紊亂。鏈霉素濃度越高,毛細胞損傷越嚴重。相同鏈霉素處理濃度下,毛細胞損傷從頂回向底回逐漸加重,其中內毛細胞和外毛細胞損傷程度類似。MTT結果顯示鏈霉素導致的HEI-OC1細胞損傷同樣隨濃度增加而加重。鏈霉素(2mg/ml)處理耳蝸基底膜后,殘留毛細胞細胞核中既有萎縮表現,也有腫脹表現。對照組基底膜毛細胞免疫熒光染色顯示AIF僅出現在細胞漿區(qū)域,細胞核區(qū)域無染色,而鏈霉素處理后,毛細胞AIF染色增強,并且細胞核區(qū)域出現了明顯染色。HEI-OC1細胞中,免疫熒光顯示鏈霉素(5mg/ml)處理后AIF散在出現在細胞核中,Western-blot顯示鏈霉素處理后細胞線粒體內AIF表達降低,細胞質內表達量升高。免疫熒光顯示對照組基底膜毛細胞和HEI-OC1細胞均未見明顯PARP-1染色,鏈霉素處理后細胞核出現了 PARP-1強染色。qRT-PCR顯示鏈霉素處理后HEI-OC1細胞PARP-1 mRNA表達明顯升高,Western-blot顯示PARP-1蛋白表達明顯升高。加入3-AB后,MTT檢測顯示鏈霉素造成的HEI-OC1細胞損傷減輕,而且Western-blot結果也顯示鏈霉素造成的AIF線粒體中蛋白表達降低而細胞質中升高的趨勢消失。研究結論:鏈霉素可以導致耳蝸毛細胞濃度和位置依賴性的損傷;鏈霉素損傷毛細胞過程中AIF從線粒體轉位到細胞核和細胞質;AIF的轉位過程受PARP-1調控。第二部分內毛細胞帶狀突觸在聯合應用鏈霉素和速尿導致的大鼠聽力損失中的改變研究目的:目前氨基糖苷類抗生素耳毒性的研究多集中在其如何損傷耳蝸毛細胞和螺旋神經節(jié)細胞等,還沒有文章探討聽覺傳導通路中第一個信號傳遞點——帶狀突觸,在急性藥物性耳聾中的改變。耳蝸中帶狀突觸是一種特化的突觸連接,位于毛細胞和螺旋神經節(jié)細胞之間,對聲音信號快速、持續(xù)而準確的傳遞有著重要的作用。目前研究認為,帶狀突觸可能是聽覺通路中最脆弱的部分。我們希望通過速尿和鏈霉素聯合應用構建大鼠急性聽力損失模型,探討藥物作用下內毛細胞帶狀突觸的改變。研究方法:大鼠同時分別腹腔注射速尿(200m/kg)和肌肉注射硫酸鏈霉素(200mg/kg)以構建大鼠急性聽力損失模型。聽性腦干反應(ABR)檢測大鼠各頻率的聽閾;CtBP2、GluR23、Myosin Ⅶa以及Tuj-1免疫熒光染色分別標記突觸前部分、突觸后部分、毛細胞和螺旋神經節(jié)細胞并進行相應的統(tǒng)計分析。研究結果:ABR顯示大鼠同時注射速尿和鏈霉素后1 d即出現全頻的聽力損失,且1月后仍不能恢復。與對照組相比,藥物處理后大鼠基底膜毛細胞CtBP2染色顯示帶狀突觸數目明顯減少,呈自頂回向底回逐漸加重的趨勢,且其損失程度比內毛細胞減少程度更嚴重。藥物處理后殘留的部分突觸出現腫脹、位置移動等異常表現,且與數目減少程度呈正相關。CtBP2和Glu R23標記的突觸前后部分在藥物處理10 d后明顯分離。藥物處理10 d后螺旋神經節(jié)細胞無明顯改變,但是1月后其胞體和神經纖維明顯減少,且以頂回和中回為甚。研究結論:速尿和鏈霉素聯合應用可以引起大鼠不可逆的全頻聽力損失;速尿和鏈霉素引起的早期聽力損失可能由帶狀突觸損傷引起。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R764
【部分圖文】：

圖２．內毛細胞帶狀突觸模式圖逡逑考文獻（Ｌｉｂｅｒｍａｎ邋Ｍ邋Ｃ．邋Ｎｏｉｓｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ａｎｄ邋ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ邋ｈｅａｒｉｓ邋ａｎｄ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ邋ｔｈｅｒａｐｉｅｓ［Ｊ］．邋ＦＩＯＯＯＲｅｓ，邋２０１７，邋６：邋９２７）邋［４５］0逡逑聽力損失與帶狀突觸逡逑宄認為，帶狀突觸的損傷在噪音性聽力損失中可能起到強度聲音暴露后可以產生暫時性的聽力閾移。對小鼠進，短期內毛細胞和螺旋神經節(jié)細胞沒有發(fā)生明顯改變，�。蟹迪陆�，突觸數目明顯減少，形態(tài)異常，脫離噪聲環(huán)恢復正常，但是ＣＡＰ幅值和突觸數目并未完全恢復，而旋神經節(jié)細胞也會出現損失［４６；４８；４９］。此外，Ｓｈｉ等對豚鼠傷的突觸可以部分修復，但是再生的突觸在時相處理等功考慮到低強度噪音在現代生活中相對較多的接觸機會，可能逐累，導，

時基底膜也出現了不同程度的萎縮。不同位置的毛細胞對于鏈霉素的反應也不同。逡逑相同濃度下，底回毛細胞對于鏈霉素最敏感，損傷最重，中回次之，頂回則無明逡逑顯變化（圖１）。逡逑隨著鏈霉素濃度的升高，毛細胞缺失比例也逐漸嚴重。統(tǒng)計分析發(fā)現，鏈逡逑霉素濃度越高，內毛細胞和外毛細胞的損傷程度越重。除頂回外，ｌｍｇ／ｍｌ鏈霉逡逑素即可引起內毛細胞明顯缺失，２ｍｇ／ｍｌ及更高濃度鏈霉素可引起外毛細胞明顯缺逡逑失（Ｐ＜０．０５）。相同位置和相同濃度鏈霉素作用下，內毛細胞和外毛細胞的缺失逡逑情況則無明顯差異（辦0．0５）（圖１）。逡逑根據以上結果，后續(xù)實驗中損傷基底膜時使用的鏈霉素濃度被確定為逡逑２ｍｇ／ｍｌ0逡逑１．２鏈霉素對于ＨＥ卜０Ｃ１細胞的損傷逡逑本研宄通過ＭＴＴ法檢測不同濃度的鏈霉素對于連續(xù)培養(yǎng)的ＨＥＩ－ＯＣ１細胞的逡逑損傷作用。試驗中選取了邋１邋ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１邋Ｏｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、逡逑３０ｍｇ／ｍｌ和４０ｍｇ／ｍｌ共計８個不同濃度。以１５ｍｇ／ｍｌ鏈霉素為例，藥物處理２４ｈ逡逑后可以看到ＨＥＩ－０Ｃ１細胞數目明顯減少，胞體明顯萎縮，細胞核皺縮，形成空逡逑泡樣的外觀

逑相比明顯下降（戶＜０．０５），５ｍｇ／ｍｌ鏈霉素存活率降至７８．３３±２．４０％，１５ｍｇ／ｍｌ鏈逡逑霉素存活率降至４５．１５６士８．００％邋（圖２Ｂ）。逡逑根據以上結果，考慮到藥物損傷是逐漸進展的過程，５ｍｇ／ｍｌ濃度的鏈霉素逡逑己可引起相應的基因及蛋白改變，更高濃度的鏈霉素的損傷較重，可能引起其他逡逑細胞死亡相關通路的改變，本實驗后續(xù)損傷ＨＥＩ－ＯＣ１細胞的鏈霉素濃度被確定逡逑為邋５ｍｇ／ｍｌ0逡逑Ａｐｅｘ邐Ｍｉｄ邐Ｂａｓｅ逡逑Ｏｍｏｍｌ逡逑一逡逑ｓ邋｜Ｍ邐ＩＮ邐Ｏ邐ｎ0Ｈｒ逡逑＂ｃ邋ｌｏｏｊ邋Ｔｉ—■邐ｌ0？－｜邋Ｔ邋Ｔ邐ｌ，Ｍ，－邋Ｔ邋＊ｒ邐ＣＱＩＨＣ逡逑＿Ｐ邋＿邋Ｓ媝說邐媝ｉ邐■．逡逑：ｉＭｊｍ丨W＿，邋＿邋＿丨X櫻呶義希埃恚簀澹恚戾澹歟恚玨澹恚戾澹玻恚輳ǎ恚戾澹擔恚澹恚戾危希恚鑠澹恚戾澹桑恚輳螅В恚戾澹玻恚隋澹恚戾澹擔恚椋翦澹恚戾

本文編號：2809132