【摘要】：背景白內(nèi)障是由于晶狀體渾濁,透光度降低引起的視力障礙,是人類致盲的主要原因之一。根據(jù)白內(nèi)障發(fā)生時期不同可以將白內(nèi)障分為先天性白內(nèi)障和老年性白內(nèi)障。而先天性白內(nèi)障是兒童致盲的常見原因,先天性白內(nèi)障多余多基因突變有關,根據(jù)致病基因的功能不同可以大致分為六大類:晶狀體蛋白基因、間隙連接蛋白基因、發(fā)育調(diào)控因子基因、細胞骨架蛋白基因、酪氨酸激酶受體基因和染色質修復蛋白基因。間隙連接蛋白作為重要的細胞膜蛋白,是組成細胞間間隙連接通道的重要亞基,具有介導細胞之間生物小分子的轉運功能,例如:代謝產(chǎn)物、離子和第二信使等。間隙連接在維持細胞穩(wěn)態(tài)與晶狀體分化及其穩(wěn)態(tài)的過程中發(fā)揮著重要作用。在人類晶狀體中組成間隙連接通道的亞基根據(jù)分子量不同可以分為:Cx43、Cx46和Cx50,它們分別由基因:GJA1、GJA3和GJA8基因編碼。研究表明,GJA3和GJA8功能異常導致先天性白內(nèi)障的發(fā)生。目前,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過20個GJA3基因突變和23個GJA8基因突變與人類先天性白內(nèi)障相關,而GJA3或者GJA8基因的突變可能會導致其編碼的Connexin的結構、功能等發(fā)生改變,繼而影響細胞間間隙連接通道功能異常,最終誘發(fā)白內(nèi)障。但是,間隙連接蛋白基因突變導致先天性白內(nèi)障的具體分子機制并不完全清楚。目的1.鑒定兩個常染色體顯性遺傳的先天性白內(nèi)障家系的致病基因。2.初步探究GJA3和GJA8基因突變導致兩個家系發(fā)生先天性白內(nèi)障的分子機制。方法1.倫理授權在對白內(nèi)障家系研究之前,我們向河南大學倫理委員會和開封中心醫(yī)院倫理員會提交針對臨床標本進行研究申請,并通過倫理委員會的審核。2.臨床診斷與家系分析我們與開封市眼科醫(yī)院合作收集到白內(nèi)障家系,在取得家系成員知情同意的情況下,由專業(yè)眼科醫(yī)生對家系成員進行詳細的眼科檢查(視力檢查、裂隙燈檢查)和相關病史的調(diào)查。通過繪制家系圖譜初步確定家系患有的白內(nèi)障的遺傳方式。3.全血基因組DNA提取以及候選基因篩查及鑒定在確定家系患有的白內(nèi)障并非其他疾病的并發(fā)癥之后,我們抽取家系成員的外周血,隨后抽提外周血基因組DNA,并利用PCR將11對候選基因(cryaa,cryab,crybb1,cybb2,crygc,crygd,GJA3,GJA8,Hsf4,Mip,Pitx3)進行擴增,將PCR產(chǎn)物進行外顯子測序(金唯智公司)和基因序列分析,初步確定致病基因。4.利用免疫印跡法測定野生和突變間隙連接蛋白在病人晶狀體組織中的表達量收集家系成員白內(nèi)障手術中獲取的晶狀體前囊上皮組織,利用蛋白免疫印跡法檢測家系中白內(nèi)障患者與對照組老年性白內(nèi)障病人晶狀體中間隙連接蛋白的表達量。5.免疫熒光技術測定間隙連接蛋白亞細胞定位方式以及Cx50在小鼠晶狀體的表達和分布情況構建表達GFP-WT-Cx50、GFP-Insert-Cx50,將質粒轉染HLE細胞,利用免疫熒光技術觀察Cx50在細胞中的定位方式。CX50在小鼠晶狀體組織內(nèi)的表達量和分布為了檢測Cx50在小鼠晶狀體中的分布情況,選取不同周齡(年齡)的小鼠,取其晶狀體進行石蠟切片。隨后進行免疫熒光染色,通過激光共聚焦顯微鏡觀察Cx50在小鼠晶狀體中的分布情況。6.間隙連接蛋白的半通道功能檢測將 GFP-WT-Cx50、GFP-Insert-Cx50 質粒瞬時轉染入 HLE,利用 dye uptake assay 檢測PI染料通過野生型Cx50與突變型Cx50的能力,以此說明間隙連接蛋白的半通道功能是否發(fā)生異常。7.MTT實驗測定突變型間隙連接蛋白對細胞增殖能力影響將GFP-WT-Cx50、GFP-Insert-Cx50質粒瞬時轉染HLE細胞,利用MTT法,檢測HLE細胞的增殖速度,以此說明突變型Cx50對細胞增殖能力的影響。結果1.CX46移碼突變與一個家族顯性遺傳性白內(nèi)障發(fā)生相關。應用遺傳圖譜分析技術,我們對一個患有先天白內(nèi)障的家系進行分析,確定該家系為家族顯性遺傳性白內(nèi)障家系。提取家系內(nèi)正常人,先證和其他患者外周血的DNA,通過PCR擴增11對先天性白內(nèi)障候選基因的外顯子,并進行測序。結果顯示,先證者GJA3基因cDNA的1195位點后插入堿基C(c.1194_1195ins C),導致Cx46 C末端400位氨基酸后發(fā)生移碼突變(Cx46fs400),并且該突變在該家系里共分離。為了探究Cx46fs400對Cx46蛋白的影響,我們利用生物信息學對Cx46蛋白的生化性質進行預測。結果發(fā)現(xiàn),該突變可能會引起Cx46的疏水性增加,同時可能會引起Cx46的二級結構發(fā)生改變。為了確定該突變是否會影響Cx46在病人晶狀體中的蛋白穩(wěn)定性,我們檢測了該家系中先證者的晶狀體組織中Cx46的表達水平。結果顯示,Cx46fs400導致Cx46表達水平顯著降低(CuiX K,Zhu K K,Zhou Z,et al.A novel frameshift mutation in CX46 associated with hereditary dominant cataracts in a Chinese family.[J].International Journal of Ophthalmology,2017,10(5):684-690.)。2.鑒定出一個新的GJA8基因插入突變(c.285ins)與家族顯性遺傳性白內(nèi)障發(fā)生相關。通過對先天性白內(nèi)障家系二(共三代10人,6患者)的家系遺傳圖譜分析,確定該家系的遺傳方式為常染色體顯性遺傳。提取家系中正常人,先證者和其他患者的外周血的DNA,通過PCR技術擴增11對先天性白內(nèi)障的候選基因的外顯子,并進行測序。結果表明,先證者的GJA8的cDNA的285位點后插入了 15個堿基(tacgcggtgcactac)(c.285ins),導致Cx50第二跨膜區(qū)插入了五個氨基酸殘基(YAVHY)(p.H95_A96insYAVHY)。通過免疫熒光技術檢測結果顯示,該突變引起了 Cx50由膜定位方式改變?yōu)榘|定位。利用dye uptake assay技術檢測Cx50的半通道功能,結果顯示,該突變引起了 Cx50的半通道功能受損。隨后我們利用免疫熒光技術觀察Cx50是否與內(nèi)質網(wǎng)標志蛋白GRP78、溶酶體標志蛋白lampl共定位。結果顯示,該突變能夠引起Cx50與內(nèi)質網(wǎng)、溶酶體共定位。MTT法檢測瞬時轉染GFP-WT-Cx50和GFP-Insert-Cx50的HLE細胞增殖速率。發(fā)現(xiàn),該突變并不影響細胞的增殖。最后,為了探究Cx50在小鼠晶狀體發(fā)育過程中的表達分布情況。我們選擇4周齡的小鼠晶狀體,進行石蠟切片和組織免疫熒光染色。結果顯示,Cx50在小鼠晶狀體赤道部分布表達較多。(Cui X,Zhou Z,Zhu K,et al.A Novel Cx50 Insert Mutation from a Chinese Congenital Cataract Family Impairs Its Cellular Membrane Localization and Function[J].DnaCell Biology,2018,37(5):449-456.)結論1.在一個家族顯性遺傳白內(nèi)障家族DNA中,發(fā)現(xiàn)一個新的GJA3移碼突變。GJA3 cDNA在1195位點后插入一個堿基C,導致Cx46蛋白從400位氨基酸開始移碼,該移碼突變可改變CX46蛋白的穩(wěn)定性。2.在另一家族常染色體顯性遺傳白內(nèi)障家系中,我們發(fā)現(xiàn)在GJA8基因cDNA285位點后插入15個堿基,這個新的突變體可導致Cx50第二跨膜區(qū)插入了五個氨基酸殘基(YAVHY),該突變使Cx50的細胞膜定位方式異常,并且使Cx50的半通道功能受損。
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R776.1
【圖文】：

患者丨１丨－２、１丨丨－４、ＩＩＩ－６與Ｖ－４和１１１－８，１１－２兩名正常人的的外顯子以及外顯子逡逑附近基因序列進行測序，結果發(fā)現(xiàn)：患者具有該突變，而兩名正常人基因中未發(fā)現(xiàn)移碼逡逑突變，這說明該突變在家系中存在共分離（如圖３．２）。逡逑Ｉ逡逑＊５￥逡逑？邋：－邋．．逡逑Ｐａｔｔｅｒｎ邋ｃ邋１１９５邋ｍｓｅｒｔＣ逡逑－邋－ｉｉ邋ｓｉ邋－邋ｉｉ邋．邋．邋＇ｉ邋＜■：＇邋：邋Ｖ邋４邋，邐ｉ邋．．邋．邋－：邐－邐６邋：：邋ｉ邋ｅ邐＾邐．邋：：．邋ｒ邋，邐４邋ｎ邋：邋＞．邋＊邋？‘逡逑Ｎｏｒｍａｌ逡逑圖３．２家系中先證者與正常家系成員基因測序峰圖逡逑Ｃｘ４６ＤＮＡ序列峰圖，顯示Ｃｘ４６基因１１９４與１１９５位點之間插入胞嘧啶堿基（ｃ．ｌｌ９５ｉｎｓｅｒｔＣＸＰａｔｉｅｎｔ（ＩＶ－１２）、Ｎｏｒｍａｌ逡逑（１１１－８）0逡逑２８逡逑

Ｃｘ４６氨基酸序列進行了比對，發(fā)現(xiàn)：與野生型Ｃｘ４６蛋白包含４３５個氨基酸相比，Ｃｘ４６逡逑發(fā)生該突變后，Ｃｘ４６氨基酸序列從４００位開始發(fā)生移碼，并導致Ｃ末端X椉櫻池靄被義纖�，壤_跡常常了盡ｅ義霞河醒繡潮礱鰨茫矗兜模媚┒宋揮諳赴誓�，具有信号传导等作用，晤U僑銜阱義霞湎讀擁鞍椎模媚┒�，氨基藣怛列将具有高度保蕝Q�。为另灲求Ｃｘ４６的Ｃ末堵柷否辶x暇哂斜Ｊ匭�，晤U搶檬菘庵姓頁齪愫雍鎩⑿∈�、非洲爪蟾蜍和皢h磧悖茫矗兜模媚╁義隙說陌被嶁蛄�，随后利用Ｃe酰螅簦洌兀烊砑隕細魑鎦鄭媚┒稅被嶁蛄薪行蛄斜儒義隙�。发相嵑Ｃｘ４６的Ｃ末墩b蛄性誆煌鎦旨涓叨缺Ｊ

本文編號：2807077