【摘要】：目的自身免疫性葡萄膜炎是常見的致盲性眼病,也是常見的自身免疫性疾病。由于多累及成年工作群體,可導致沉重的社會和經(jīng)濟負擔。該病的發(fā)病原因和發(fā)病機制尚不清楚。實驗性自身免疫性葡萄膜炎(Experimental autoimmune uveoretinitis,EAU)動物模型與人類自身免疫性全葡萄膜炎或后部葡萄膜炎具有相似的病理過程,是研究自身免疫性葡萄膜炎的常用工具。Wnt/β-catenin信號通路與遺傳、發(fā)育、增殖和分化等密切相關,在炎癥過程中也發(fā)揮重要作用。研究顯示,在多種自身免疫性疾病中,Wnt/β-catenin信號通路存在異常激活或抑制,但在自身免疫性葡萄膜炎中其改變狀態(tài)鮮有報道。本課題采用小鼠EAU模型檢測Wnt/β-catenin信號通路的激活狀態(tài),為解釋自身免疫性葡萄膜炎的發(fā)病機制提供新思路,并為該病的預防及治療提供新的靶點和途徑。方法1.EAU動物模型制備:采用8-10周雌性C57BL/6小鼠,分為WT組和EAU組,每組各6只。將光感受器間維生素A類結合蛋白多肽651-670(IRBP 651-670)和含有結核桿菌H37RA的完全福氏佐劑充分乳化混合,在每只小鼠背部兩側皮下注射200μl乳劑,腹腔注射100μl白喉毒素,制備抗原主動免疫的小鼠EAU模型。2.臨床觀察:各組小鼠于免疫后第6天開始隔日使用間接檢眼鏡觀察雙眼眼底炎癥表現(xiàn),參照Caspi臨床分級進行評分,同時進行小鼠眼底相干光斷層成像(OCT)檢查。3.小鼠視網(wǎng)膜組織的分離:麻醉小鼠,暴露眼球,使用彎鑷快速離斷視神經(jīng)根部并取出眼球。在解剖顯微鏡下用角膜剪將眼球的角鞏膜緣剪開,剝離角膜、虹膜、晶狀體和玻璃體。夾住外層鞏膜,輕柔地將視網(wǎng)膜組織從眼球中鈍性分離。4.實時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測參與Wnt/β-catenin通路信號激活過程的部分因子(TCF、LEF、AXIN2、MYC和Cyclin D1),分析其在視網(wǎng)膜中m RNA水平的表達情況。5.Western blot法檢測各組小鼠視網(wǎng)膜中Wnt/β-catenin通路信號蛋白β-catenin和LRP6的激活情況。6.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測各組小鼠血漿中Wnt/β-catenin通路抑制劑(DKK1、PDEF和Kallistatin)的表達水平。結果1.成功建立小鼠EAU模型并對眼底炎癥表現(xiàn)進行臨床評分。2.RT-PCR結果發(fā)現(xiàn):TCF、LEF、AXIN2、MYC和Cyclin D1在發(fā)病后的EAU組小鼠視網(wǎng)膜中表達量較wild-type(WT)組小鼠均有不同程度的上調,其中TCF、AXIN2和MYC顯著性上調(p0.05),LEF和Cyclin D1的表達量上調但無顯著性差異。3.Western blot結果顯示:EAU組小鼠發(fā)病后,β-catenin和LRP6在視網(wǎng)膜中的表達量均高于WT組小鼠(p0.05)。4.ELISA結果顯示:Wnt信號通路抑制劑DKK1和PDEF在發(fā)病后的EAU組小鼠血漿中表達量高于WT組小鼠(p0.05),Kallistatin的表達量降低,無顯著性差異。結論1.Wnt/β-catenin信號通路在自身免疫性葡萄膜炎中存在異常激活。2.Wnt/β-catenin信號通路可能成為預防和治療葡萄膜炎的新靶點,為新型藥物的研發(fā)提供新的思路。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R773
【圖文】：

圖 2 小鼠眼底 OCT 圖像。A：WT 組小鼠的 OCT 圖像視網(wǎng)膜正常無炎癥；B、C、D：EAU 組小鼠發(fā)病后的 OCT 圖像顯示從發(fā)病初期至炎癥高峰期，視網(wǎng)膜各層結構破壞逐漸加重，炎癥細胞浸潤逐漸增多，玻璃體腔也受到累及逐漸出現(xiàn)炎性細胞浸潤。2.3 Wnt 信號通路相關因子 mRNA 表達水平RT-PCR 結果顯示與 WT 組相比，誘導后第 12 天和第 18 天的 EAU 組小鼠視網(wǎng)膜組織中 Wnt/β-catenin 信號通路相關因子 TCF、LEF、AXIN2、MYC 和CyclinD1 的 mRNA 表達量均呈上調趨勢，其中 TCF、AXIN2 和 MYC 顯著性上調(p＜0.05)，LEF 和 CyclinD1 無顯著性差異（圖 3）。

11圖 3 RT-PCR 檢測小鼠視網(wǎng)膜組織中 TCF、LEF、AXIN2、MYC 和 CyclinD1 的mRNA 的表達水平。3.A：免疫后第 12 天；3.B：免疫后第 18 天。2.4 Wnt 信號通路相關因子蛋白表達水平2.4.1 Western blot 結果與對照組比較，EAU 組小鼠視網(wǎng)膜組織中 β-catenin 在誘導后第 18 天表達量明顯上調（p＜0.05）；LRP6 在誘導后第 12 天表達量出現(xiàn)上調，但無顯著性差異，在第 18 天表達量顯著上調（p＜0.05）（圖 4）。

圖 4 Western blot 檢測小鼠視網(wǎng)膜組織中 β-catenin 和 LRP6 的2.4.2 ELISA 結果EAU 組與 WT 組小鼠相比，血漿中 DKK1 在誘導后第 18(p＜0.05)；PEDF 在誘導后第 12 天濃度明顯上升(p＜0.05)；Ka第 12 和 18 天濃度呈下降趨勢，無顯著性差異（圖 5）。

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本文編號：2807266