【摘要】：第一部分：鼓室內(nèi)慶大霉素注射在外周前庭的時間和空間分布研究一、GTTR鼓室內(nèi)注射后在外周前庭的時間和空間分布 目的：應(yīng)用慶大霉素德克薩斯紅耦合物(gentamicin-conjugated Texas Red,即GTTR)鼓室內(nèi)注射后觀察其在外周前庭的時間和空間分布特點。 方法：成年豚鼠行鼓室內(nèi)GTTR(O.1mg/ml,50ul)注射一次,在注射后12h、24h、3d、7d、14d、28d處死動物,anti-Calretinin標(biāo)記前庭Ⅰ型毛細胞,DAPI染核,運用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察GTTR在外周前庭的聚集和分布情況。并進行熒光密度半定量分析。 結(jié)果：鼓室內(nèi)GTTR一次性注射后在12小時即可見在外周前庭終末器官的Ⅰ型及Ⅱ型毛細胞、移行細胞、半月面細胞有明顯聚集,在毛細胞中GTTR熒光顆粒主要聚集于表皮板及其下方,胞漿內(nèi)可見極少量的彌散性分布；移行細胞和半月面細胞中的GTTR主要分布于核上區(qū)；暗細胞、支持細胞、半規(guī)管上皮細胞未見明顯GTTR顆粒聚集。GTTR熒光顆粒在外周前庭感覺上皮3-7天聚集達到最高峰,并持續(xù)到28天熒光強度有明顯的下降(P0.05)；在移行細胞和半月面細胞至第28天仍可見明顯聚集。GTTR在球囊斑的聚集分布較橢圓囊斑多,且有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),GTTR在后半規(guī)管的分布聚集較其他兩個半規(guī)管為多,但統(tǒng)計學(xué)無顯著性差異(P0.05)。 結(jié)論：慶大霉素可聚集分布于外周前庭的感覺上皮中,其分布高峰位于3-7天,在28天有明顯下降。慶大霉素在球囊斑的分布較橢圓囊斑為多。慶大霉素可以聚集分布在移行細胞、半月面細胞中。慶大霉素在暗細胞沒有明顯分布。 二不同濃度GTTR鼓室內(nèi)注射在外周前庭的分布 目的：觀察不同濃度的GTTR鼓室內(nèi)一次性注射在半規(guī)管壺腹嵴的分布情況,從而了解不同類型的毛細胞對慶大霉素的吸收聚集特點。 方法：將不同濃度的(GTTR (0.1,0.4,0.8mg/ml)行鼓室內(nèi)慶大霉素注射后在慶大霉素時間分布的高峰第七天處死動物,anti-Calretinin標(biāo)記前庭中央?yún)^(qū)Ⅰ型毛細胞,DAPI標(biāo)記細胞核,激光共聚焦掃描顯微鏡進行,觀察不同類型的細胞的吸收聚集情況,并進行熒光半定量分析。 結(jié)果：O.lmg/mlGTTR濃度組可見慶大霉素主要分布于毛細胞的表皮板及其下方,胞漿內(nèi)可見非常微弱的熒光分布,隨著濃度的增加至0.4mg/ml,GTTR在中央?yún)^(qū)Ⅰ型毛細胞的分布由主要聚集于表皮板下到開始出現(xiàn)較多胞漿彌散性分布,至0.8mg/ml周邊區(qū)Ⅰ型毛細胞也開始出現(xiàn)較彌散性分布,GTTR在Ⅱ型毛細胞中始終聚集于頂端未出現(xiàn)胞漿明顯彌散性分布,統(tǒng)計學(xué)顯示GTTR在三種類型的毛細胞中的分布有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。GTTR在移行細胞和半月面細胞低濃度時即有分布,但并未隨著濃度的增加有明顯增加,也未出現(xiàn)胞漿彌散性分布。 結(jié)論：慶大霉素在半規(guī)管感覺上皮毛細胞的分布具有從中央?yún)^(qū)Ⅰ型毛細胞到外周區(qū)Ⅰ型毛細胞,再到Ⅱ型毛細胞的濃度梯度分布特點。慶大霉素在移行細胞和半月面核上區(qū)有明顯聚集,但并未隨濃度增加出現(xiàn)胞漿彌散性分布。 三、小劑量慶大霉素鼓室內(nèi)注射在外周前庭的分布 目的：觀察小劑量的慶大霉素鼓室內(nèi)一次性注射在外周前庭的分布情況,從而了解慶大霉素在前庭聚集分布特點,并與GTTR在外周前庭的分布進行對比。 方法：將慶大霉素(5mg/ml)行鼓室內(nèi)一次性注射第7天處死動物,Anti-Gentamicin染色,DAPI標(biāo)記細胞核,激光共聚焦掃描顯微鏡進行,觀察慶大霉素抗體染色在壺腹嵴和囊斑的熒光分布,并進行熒光半定量分析。 結(jié)果：慶大霉素在感覺上皮細胞中可呈濃度梯度分布,首先分布中央型Ⅰ型毛細胞,其次為周邊型Ⅰ型毛細胞,最后為Ⅱ型毛細胞。熒光半定量分析各類型細胞之間的分布有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),這一分布特點與GTTR相類似。慶大霉素在移行細胞、半月面細胞未見明顯聚集分布,這一現(xiàn)象與GTTR研究結(jié)果不相同。 結(jié)論：慶大霉素在壺腹嵴毛細胞的分布具有從中央?yún)^(qū)Ⅰ型毛細胞到外周區(qū)Ⅰ型毛細胞,再到Ⅱ型毛細胞的梯度分布特點。與慶大霉素抗體相比,GTTR有更高的靈敏度。 第二部分慶大霉素對外周前庭損傷性研究 目的：探討慶大霉素對外周前庭壺腹嵴和囊斑的損傷情況及其分布之間的關(guān)系。 方法：不同濃度慶大霉素(15,30mg/ml)行豚鼠鼓室內(nèi)注射后,在第7天和28天分別處死動物,三個半規(guī)壺腹嵴行冰凍切片后用anti-Calretinin標(biāo)記前庭中央?yún)^(qū)Ⅰ型毛細胞,anti-tencisin標(biāo)記所有Ⅰ型毛細胞,DAPI標(biāo)記細胞核。兩個囊斑,用phalloidin-TRIRC標(biāo)記纖毛。熒光顯微鏡及激光共聚焦掃描顯微鏡掃描拍片,Image-pro-plus圖像處理,SPSS進行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果：慶大霉素濃度15mg/ml7天組動物可見半規(guī)管中央?yún)^(qū)Ⅰ型毛細胞的神經(jīng)盞有部分回縮或者完全回縮到支持細胞層,細胞核密度較正常對照組無明顯差異。周邊型Ⅰ型毛細胞無明顯改變,慶大霉素濃度15mg/ml28天組及30mg/ml7天組可見Ⅰ型毛細胞的神經(jīng)盞均回縮到基膜層；周邊型Ⅰ型毛細胞無明顯改變或者部分減少,中央?yún)^(qū)細胞核密度較正常減少；慶大霉素30mg/ml28天組可見中央型Ⅰ型細胞均回縮到基膜層,周邊型Ⅰ型毛細胞明顯減少,中央?yún)^(qū)和周邊區(qū)細胞核均較正常減少形成單層感覺上皮細胞。慶大霉素注射后7天組動物,可見微紋區(qū)纖毛首先受損,球囊斑殘余毛細胞較橢圓囊斑多。28天組可見球囊斑纖毛較橢圓囊斑多,球囊斑較橢圓囊斑多。 結(jié)論：慶大霉素在壺腹嵴感覺上皮的損傷同分布相一致,呈現(xiàn)從中央Ⅰ型到周邊Ⅰ型最后到Ⅱ型的梯度損傷特點。慶大霉素在囊斑的損傷同分布呈負相關(guān),橢圓囊對慶大霉素損傷較球囊更為敏感。 第三部分、豚鼠外周前庭器官體外培養(yǎng)GTTR的分布特點 目的：觀察成年豚鼠外周前庭器官體外懸浮培養(yǎng)時,GTTR在外周前庭器官的聚集分布特點,并與在體分布進行比較。 方法：成年豚鼠橢圓囊斑和半規(guī)管分離,去除耳石和剪開壺腹嵴相對應(yīng)的膜性組織后進行體外培養(yǎng)。培養(yǎng)液中加有GTTR(0.00125mg/ml),在培養(yǎng)后30min、2h進行觀察,冰凍切片后anti-calretinin,Phalloidin,DAPI染色后運用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察GTTR聚集和分布情況。 結(jié)果：成年豚鼠橢圓囊斑體外培養(yǎng)在30分鐘、2小時均有較好的形態(tài),纖毛生長良好；半規(guī)管30分鐘,2小時壺腹嵴感覺上皮細胞核排列整齊。體外培養(yǎng)狀態(tài)下GTTR在壺腹嵴感覺上皮細胞中分布同在體分布,首先分布于中央?yún)^(qū)Ⅰ型毛細胞,其次為周邊區(qū)Ⅰ型毛細胞,最后為Ⅱ型毛細胞。體外培養(yǎng)時GTTR首先分布于球囊斑的微紋區(qū),與在體實驗相符。 結(jié)論：豚鼠外周終末器官體外培養(yǎng)時在壺腹和囊斑的分布與體內(nèi)類似。壺腹帽和耳石移動引起的細胞纖毛彎曲度的不同并不是壺腹嵴感覺上皮中央?yún)^(qū)和周邊區(qū)Ⅰ型細胞的分布差異的主要原因。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R764
【圖文】：

標(biāo)記細胞大部分損傷，中央?yún)^(qū)和周邊區(qū)毛細胞細胞核變稀疏，可呈現(xiàn)單層感覺上皮。（見圖2.1)2.2.2慶大霉素對囊斑的損傷：7天30mg/ml組球囊斑纖毛減少，尤以微紋區(qū)毛細胞纖毛損傷為重。橢圓囊斑纖毛減少微紋區(qū)和周邊區(qū)均有減少。進一步分析發(fā)現(xiàn)，球囊斑毛細胞損傷較橢圓囊斑毛細胞損傷為輕。，28天30mg/ml組球囊斑毛細胞殘佘纖毛較橢圓囊斑毛細胞多。（見圖2.2.)討 論研究中發(fā)現(xiàn)在壺腹嵴感覺上皮毛細胞慶大霉素分布呈現(xiàn)從中央I型到外周I型，再到II型的濃度梯度，慶大霉素的損傷具有劑量依賴性[25],因此這樣一個濃度梯度的分布是否會引起的劑量依賴梯度損傷，是值得進一步研究的問題。Calretinin被認為是前庭毛細胞傳入神經(jīng)軸突的標(biāo)記，Lysakwsk研究表明calretinin可以標(biāo)記膝鼠90%以上的中央?yún)^(qū)的I型毛細胞，并且是一個良好的界定中央?yún)^(qū)和周邊區(qū)的標(biāo)記物[6

圖3.2橢圓囊斑體外培養(yǎng)狀態(tài)下對慶大霉素的吸收。左上圖為在體狀態(tài)下的0.4mg/mlGTTR在橢圓囊斑分布，綠色為calretinin。右上圖為培養(yǎng)狀態(tài)下30分鐘GTTR(0.00125mg/ml)的分布，綠色均為Phalloidin-FITC ,基本分布同在體相同，右下圖為培養(yǎng)狀態(tài)下2小時GTTR (0.00125mg/ml)的分布，綠色均為Phalloidin-FITC，基本分

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 戴春富;張國明;張茹;劉建平;遲放魯;王正敏;;小劑量慶大霉素鼓室內(nèi)注射治療難治性梅尼埃病眩暈的臨床研究[J];臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2007年04期

2 丁大連,蔣海燕,王家東,楊軍,Richard J.Salvi;卡鉑對離體培養(yǎng)成年灰鼠前庭毛細胞的損害[J];聽力學(xué)及言語疾病雜志;2003年04期

3 劉建平;戴春富;王正敏;遲放魯;田潔;笪翠弟;;慶大霉素鼓室內(nèi)注射后在內(nèi)耳細胞中的分布[J];中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2006年11期

本文編號：2800814