【摘要】：研究背景和目的開發(fā)一種以介孔硅納米粒子(mesoporous silicananoparticles,MSNS)為載體,采用聚多巴胺(polydopamine,PDA)進行載體表面改良,使之具有pH敏感性的新型藥物載體系統(tǒng)。通過MSNs-ISO@PDA和MSNs-ISO控制異鼠李素(Isorhamnetin,ISO)釋放效率的差異,探討PDA對粒子表面改良的影響,MSNs-ISO@PDA在鼻咽癌中抗腫瘤功效以及相關分子機制。方法和材料1.材料正硅酸乙酯(TEOS),十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)鹽酸多巴胺和鹽酸去郁敏購買自Sigma-Aldrich公司(St.Louis,MO,USA)。氟化銨從阿拉丁實業(yè)有限公司購買。乙腈和甲醇均購自EMScience(HPLC級,MallinckrodtBaker,美國)。在這項工作中使用的主要抗體包括LC3抗體(兔源)是從Cell Signaling Technology公司購買(Beverly,MA,USA)。P62抗體是從Abmart公司購買(上海,中國)。Beclin 1 購自 Cell Signaling Technology 公司(Beverly,MA,USA).AKT,P-AKT、mTOR、p-mTOR、p-p70S6K、p70S6K 抗體購自 Santa Cruz(Santa Cruz,CA,USA)。人鼻咽癌 CNE-2 細胞從 American Type Culture Collection(ATCC)購買。用于整個研究的水從超純MilliQ水凈化系統(tǒng)獲得(電阻18 MU cm)。2.方法2.1通過滴入正硅酸乙酯(TEOS)到十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和氟化銨(NH4F)的混合溶液中進行合成MSNs。裝載ISO和阿霉素(DOX)并采用PDA進行粒子表面改良。MSNs-DOX@PDA和空白對照(MSNs@PDA)以同樣的方法制備。采用一系列儀器和方法對納米顆粒進行鑒定,同時分析和測定MSNs-ISO@PDA的藥物載量。2.2 對 CNE-2 細胞分別用 FITC-MSNs-ISO 和 FITC-MSNs-ISO@ PDA 處理。采用共聚焦顯微鏡分析比較細胞對FITC-MSNs-ISO和FITC-MSNs-ISO @ PDA的吸收效率;噻唑藍法(MTT)及細胞流式細胞儀檢測細胞壞死及凋亡;RT-PCR、Western blot 和免疫熒光(Immunofluorescence IF)檢測 MSNs@PDA、游離 ISO和MSNs-ISO@PDA在CNE-2細胞中對細胞自噬的影響。2.3 皮下接種CNE-2細胞建立人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,隨機分為4組:生理鹽水組(Control)、MSNs@PDA 組、ISO 組、MSNs-ISO@PDA,評估治療后對種植瘤生長抑制作用;并通過體重監(jiān)測評估體內MSNs-ISO@PDA的系統(tǒng)毒性。結果1.MSNs、MSNs-ISO 和 MSNs-ISO@PDA 顆粒的直徑分別是 146.54±4.55、152.45±3.74 和 168.53±4.66nm。MSNs,MSNs-ISO 和 MSNs-ISO@PDA 的 zeta電位分別是-20.11±4.25,-10.57±3.42 和-32.56±3.37 mV。MSNs 的 BET 比表面積為246.46m2/g,孔體積為0.57 cm3/g,由BJH評價法測定最可能的孔徑約為2.74 nm。隨著負載ISO后,顆粒的BET比表面積和最可能孔徑分別減小到132.35 m2/g 和 2.36nm。MSNs-ISO@PDA 的 BET 比表面積為 43.68m2/g。然而,由于表面的PDA涂層,MSNs和ISO-MSNs孔體積分別變成0.15和0.11 cm3/g。MSNs對ISO的負載效率約為96.63±3.42。2.在CNE-2細胞中,細胞對FITC-MSNs-ISO @ PDA的攝取效率明顯高于FITC-MSNs-ISO;流式細胞分析技術也證實了細胞對FITC-MSNs-ISO@PDA的攝取效果更強MSNs-ISO@PDA比游離ISO和MSNs@PDA對CNE-2細胞的生長抑制更為明顯;MSNs-ISO@PDA通過抑制AKT-mTOR-p70S6K信號通路誘導細胞自噬,促進細胞死亡。3.MSNs-ISO@PDA組顯示出對種植瘤的生長抑制作用最強,在實驗組中腫瘤生長較生理鹽水對照組明顯減慢;通過體重監(jiān)測評估體內MSNs-ISO@PDA的系統(tǒng)毒性,MSNs-ISO@PDA組和其他組之間的體重差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05,數據未顯示)。結論本實驗研究成功地設計了一種pH敏感的,以介孔二氧化硅納米粒子為介導材料,并覆蓋PDA涂層的藥物傳遞系統(tǒng)。此外,MSNs-ISO@PDA通過誘導鼻咽癌細胞自噬作用而促進細胞死亡,從而具有良好的抗癌療效。實驗結果表明,相比之下負載ISO的MSNs-ISO@PDA藥物載體系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)勢,包括良好的pH敏感性,更適宜于鼻咽癌細胞的攝取和治療時低副作用等方面特點。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.63
【圖文】：

邐第一章合成和鑒別納米顆粒、體外藥物釋放實驗邐逡逑Ｔａｂｌｅｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ邋ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ邋ｏｆ邋ＭＳＮｓ，邋ＭＳＮｓ－ＩＳＯ邋ａｎｄ邋ＭＳＮｓ－ＩＳＯ＠ＰＤＡ逡逑Ｓａｍｐｌｅ邐Ｓｉｚｅａ邐ＺＰ邐ＢＥＴ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋Ｐｏｒｅ邋ｖｏｌｕｍｅ１５邋Ｐｏｒｅ邋ｓｉｚｅｃ逡逑（ｎｍ）邐（ｍＶ）邋ａｒｅａ邋（ｍ２／ｇ）邐（ｃｍ３／ｇ）邐（ｎｍ）逡逑ＭＳＮｓ邐１４６．５４土４．５５邐－２０．１１邋士４．２５邐２４６．４６邐ｑ邋５７邐２邋７４逡逑佭－ＩＳ0邐１５２．４５±３．７４邐－，０．５７±３．４２邐，３２．３５邐２Ｊ６逡逑ＭＳＮｓ－ＩＳＯ＠ＰＤＡ邐１６８．５３士４．６６邐－３２．５６士３．３７邐４３．６８逡逑０．１３邐－逡逑（ａ）用動態(tài)光散射法測量粒徑。邐一邋一逡逑（ｂ）邐ＢＪＨ評價法測定孔體積為１．７和３００納米的寬度之間的孔隙。逡逑（ｃ）最可能的孔徑。逡逑（ａ）邐ＮＰｓ邋ｓｉｚｅ邋ｗａｓ邋ｍｅａｓｕｒｅｄ邋ｂｙ邋ｄｙｎａｍｉｃ邋ｌｉｇｈｔ邋ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ．Ｄａｔａ邋ａｒｅ邋ｍｅａｎ邋士ＳＤ逡逑（ｂ）邐ＢＪＨ邋ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ邋ｐｏｒｅ邋ｖｏｌｕｍｅ邋ｆｏｒ邋ｐｏｒｅｓ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋１．７邋ａｎｄ邋３００邋ｎｍ邋ｉｎ邋ｗｉｄｔｈ．逡逑（ｃ）邐Ｍｏｓｔ邋ｐｒｏｂａｂｌｅ邋ｐｏｒｅ邋ｓｉｚｅ．逡逑Ａ逡逑

１．３．２體外實驗表明藥物釋放對ＰＨ敏感逡逑為了驗證ＰＤＡ涂層的藥物封閉效果和ｐＨ敏感性，我們在不同的特定時間逡逑間隔下分別對ｐＨ值為５和ｐＨ為７．４兩種條件檢測藥物釋放情況。如圖２Ａ所示，逡逑沒有ＰＤＡ涂層時，ＤＯＸ在所有測試的ｐＨ值條件下迅速釋放，即從ＭＳＮｓ的孔逡逑中通過自由擴散進入溶液。然而，在ｐＨ值７．４下，不同于ＭＳＮｓ邋－ＤＯＸ快速釋逡逑放的是，ＭＳＮｓ－邋ＤＯＸ邋＠邋ＰＤＡ具有ＤＯＸ持續(xù)釋放速率，這表明ＰＤＡ涂層有效逡逑保護ＤＯＸ從ＭＳＮｓ泄漏的作用（參見圖２Ｂ）。有趣的是，ＭＳＮｓ－ＤＯＸ＠ＰＤＡ逡逑在ｐＨ值為５時比ｐＨ值為７．４時ＤＯＸ的釋放速率有明顯的加快（參見圖２Ｂ），逡逑Ａ邐Ｂ逡逑８０逡逑－？－５．０邐－＊－５．０逡逑１00－邋－？－７．４邐７0邋—＊－７．４邐ｒ逡逑ｒ／邐ｒｆｒ＋＾＾＾逡逑�。海姡椋驽义希板�0邐５邐１0邐１５邐２０邐２５邐0邋２０邐４０邐６０邐８０邐１００邐１２０邐１４０邐１６０逡逑Ｔｉｍｏ（ｈ）邐Ｔｉｍｏ（ｈ｝逡逑圖２邋（Ａ）無ＰＤＡ涂層時ＤＯＸ釋放曲線（ＰＨ值＝５時與ＰＨ值＝７．４時釋放速率差異不逡逑大）。（Ｂ）有ＰＤＡ涂層時ＤＯＸ釋放曲線（ＰＨ值＝５時比ＰＨ值＝７．４時釋放速率明顯加快）。逡逑３３逡逑

ＦＩＴＣ－ＭＳＮｓ－ＩＳＯ邋和邋ＦＩＴＣ－ＭＳＮｓ－ＩＳＯ邋＠邋ＰＤＡ邋的吸收效率。結果表明，在邋ＣＮＥ－２逡逑細胞中，細胞對ＦＩＴＣ－ＭＳＮｓ－ＩＳＯ邋＠邋ＰＤＡ的攝取效率明顯高于ＦＩＴＣ－ＭＳＮｓ－ＩＳＯ。逡逑（圖３邋Ａ）流式細胞分析技術也證實了細胞對ＦＩＴＣ－ＭＳＮｓ－ＩＳＯ＠ＰＤＡ的攝取效逡逑果更強（圖３Ｂ），可見細胞攝�。疲桑裕茫停樱危螅桑樱希溃校模翢晒鈴姸葦抵得黠@更高逡逑（Ｐ＜０．０１）。這種增加可能是由于ＰＤＡ修飾的原因。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑ＤＡＰＩ邐ＦＩＴＣ邐Ｍｅｒｇｅ邐■ＦＩＴｃ＊ｍｓｎ．＊？ｓｏ逡逑■邐ＲＴＣ＜ＭＳＮ？＜ＩＳ0ＳＰＤＡ逡逑枿懰｜邋３００0Ｊ邐Ｉ逡逑ＭｙｊＬ．；；ｊＰＨＮ１ＳＮ－，Ｓ（＞ａＰ，）Ａ邐＝邋２000－邐｜ＨＨ逡逑ＵＫｓａｍＢＭ逡逑圖３邋細胞對ＦＩＴＣ－ＭＳＮｓ－ＩＳＯ邋＠邋ＰＤＡ的攝取效率明顯高于ＦＩＴＣ－ＭＳＮｓ－ＩＳＯ逡逑圖Ａ共聚焦顯微鏡下顯示ＤＡＰＩ和Ｆ１ＴＣ染色試驗可見細胞對ＭＳＮｓ－ＩＳＯ邋＠邋ＰＤＡ攝取逡逑效率更高。逡逑圖Ｂ為流式細胞分析技術

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 Mario Paulus Cesar B.Sarmiento;Michael Benedict A.Mejia;;Preliminary assessment of nasopharyngeal carcinoma incidence in the Philippines: a second look at published data from four centers[J];Chinese Journal of Cancer;2014年03期

2 何峰;王永林;鄭林;劉麗君;王愛民;李勇軍;黃勇;;UPLC-PDA-ESI-MS分析杜仲中化學成分[J];中國實驗方劑學雜志;2014年03期

本文編號：2790264