【摘要】：目的:中耳膽脂瘤是由角化鱗狀上皮在顳骨內(nèi)異常生長而形成的一種界限清楚的囊性病變,由它引起的膽脂瘤型中耳炎是耳鼻咽喉科的常見疾病。像腫瘤一樣膽脂瘤上皮細胞具有高度的增殖活性,盡管目前研究膽脂瘤病理機制的方向很多,爭議也很多,然而沒有一種學說理論能夠完整的解釋膽脂瘤的所有臨床特征,但膽脂瘤上皮細胞具有高度的增殖活性被認為是該病的基本特征。miRNAs參與了包括增殖、分化、凋亡和遷移等一系列重要的生命進程,具有廣泛而重要的生物功能。特別是很多miRNAs對腫瘤的生長、遷移和侵襲具有抑制作用,發(fā)揮著抑癌功能,更是成為研究的熱點。miR-203a具有上皮組織特異性,是影響上皮細胞生長、分化以及功能的重要分子,并在上皮源性腫瘤中發(fā)揮著防癌、抑癌的作用。同時,miR-203a是調(diào)控角質(zhì)形成細胞增殖和定向分化的關鍵因子,它的出現(xiàn)抑制了細胞的干性,使細胞停止增殖,開始定向分化。通過生物信息學軟件分析,我們發(fā)現(xiàn)人類Bmi1基因是miR-203a的預測靶基因。Bmi1歸屬于是Polycomb家族,是具有遺傳修飾作用的轉錄抑制因子,主要通過改變?nèi)旧w的結構來沉默相關基因的表達。它在人體多數(shù)組織和大量惡性腫瘤中均有表達,在維持正常細胞和腫瘤細胞的干性和自我更新方面起著至關重要的作用。膽脂瘤因為也具有包括異常的增殖、遷移和侵襲等很多類似腫瘤的特性,所以我們推測發(fā)揮抑癌作用的miRNAs在膽脂瘤中的表達可能會有變化。目前,國內(nèi)外關于miRNAs在膽脂瘤中的報道比較少見,而對于起到調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細胞增殖分化作用的miR-203a及其預測靶基因——維持細胞干性的Bmi1在膽脂瘤中的報道更是沒有出現(xiàn)過。我們通過檢測miR-34a、miR-125a和mi R-203a三種常見的起抑癌作用miRNAs在膽脂瘤和耳后正常皮膚中的表達情況,篩查出mi R203a在膽脂瘤中的表達明顯低于耳后正常皮膚,緊接著分析miR-203a在膽脂瘤中的表達量與膽脂瘤的臨床類型等特征是否具有相關性。我們預測了miR203a的靶基因Bmi1,并通過檢測Bmi1在膽脂瘤及其對應的耳后正常皮膚中的表達和分布情況,分析這種表達是否存在差異,同時分析Bmi1在膽脂瘤中表達與miR-203a的表達是否有相關性。最終通過雙熒光素酶活性檢測分析和在人角質(zhì)形成細胞中的調(diào)控實驗來驗證它們的靶向關系是否成立。為了模擬膽脂瘤中miR-203a的表達下調(diào),我們在人角質(zhì)形成細胞轉染miR-203a抑制劑,檢測細胞的生物學行為是否朝著膽脂瘤的方向發(fā)展。目前已經(jīng)有很多研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤中Bmi1能夠通過提高Akt的磷酸化水平,進而調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。同時,也有相關研究證實Akt的磷酸化水平升高也存在于膽脂瘤當中。因此我們檢測膽脂瘤中p-Akt蛋白的表達情況以及與Bmi1的表達是否相關,最后在角質(zhì)形成細胞中驗證miR-203a能否通過調(diào)節(jié)Bmi1來影響p-Akt的表達進而調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路的活性。目前國內(nèi)外尚無報道m(xù)iR-203a和Bmi1在膽脂瘤中表達情況以及調(diào)節(jié)機制的研究,希望本研究能為日后更深入的探索膽脂瘤發(fā)病機制的提供一定的幫助,為該病的預防和診治提供一個新的方向。研究方法:研究對象和實驗材料:共計56例膽脂瘤標本和28例耳后皮膚標本,其中有20對膽脂瘤標本和耳后皮膚標本取材自同一患者,為自身對照�；颊呷朐汉笫占ㄐ詣e、年齡、病程、臨床分型、是否首發(fā)、有無并發(fā)癥等臨床信息。所有患者均經(jīng)臨床和病理檢查證實為后天性中耳膽脂瘤的患者。實驗所用細胞為人永生角質(zhì)形成細胞(HaCaT細胞),在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,37℃,5%CO2的條件下培養(yǎng)。實驗方法:1、采用實時熒光定量PCR檢測miR-203a、miR-34a和mi R125a在膽脂瘤組織和耳后正常皮膚組織中的表達情況。2、運用實時熒光定量PCR和western blot分別檢測miR-203a和Bmi1在膽脂瘤組織中和與其對應的耳后正常皮膚組織中的表達情況。3、免疫組織化學染色觀察Bmi1在膽脂瘤和耳后正常皮膚組織中的表達和分布情況。4、人永生角質(zhì)形成細胞(HaCaT細胞)培養(yǎng)。5、采用瞬時轉染將NC miR-mimics、miR-203a mimics、NC mi R-inhibitor和miR-203a inhibitor分別轉染到HaCaT細胞中,應用real-time PCR和western blot檢測Bmi1在各組細胞中mRNA和蛋白的表達水平。6、雙熒光素酶基因報告檢測分析miR-203a和Bmi1的靶向關系。7、采用瞬時轉染將NC mi R-inhibitor、miR-203a inhibitor、Bmi1 siRNA、NC siRNA以及miR-203a inhibitor+Bmi1 siRNA轉染到各組人角質(zhì)形成細胞中,western blot檢測轉染效率,并培養(yǎng)24-48小時為后續(xù)實驗準備。8、采用細胞集落克隆實驗檢測各組人角質(zhì)形成細胞的集落形成能力。9、細胞增殖MTS實驗檢測各組人角質(zhì)形成細胞的增殖情況。10、使用流式細胞儀對各組人角質(zhì)形成細胞周期進程的變化進行檢測。11、使用流式細胞儀對各組人角質(zhì)形成細胞進行凋亡發(fā)生率的檢測。12、人角質(zhì)形成細胞遷移能力的檢測使用Transwell細胞遷移實驗。13、使用Western blot檢測膽脂瘤和耳后皮膚組織中p-Akt蛋白的表達情況。14、應用免疫組化染色檢測p-Akt在膽脂瘤和皮膚組織中的表達和分布情況。15、Western blot檢測不同轉染組的人角質(zhì)形成細胞中Bmi1、Total-Akt和p-Akt的表達情況。結果:1、real-time PCR檢測結果顯示miR-203a在膽脂瘤中的表達顯著低于耳后正常皮膚組織,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。miR-34a和miR125a在膽脂瘤和耳后正常皮膚中的表達無顯著差異。2、miR-203a在膽脂瘤中的表達量與患者的性別、年齡、病史長短、是否首發(fā)、有無并發(fā)癥以及膽脂瘤的分型等臨床特征均無明顯相關性(P0.05)。3、在20例有自身對照的膽脂瘤患者中,miR-203a在膽脂瘤中的表達均顯著低于其對應的耳后正常皮膚組織,相反Bmi1蛋白在膽脂瘤中的表達則明顯高于其對應的皮膚組織,person相關分析結果顯示二者之間存在顯著的負相關(P0.05)。4、免疫組織化學顯示Bmi1主要為細胞核染色,在膽脂瘤上皮中幾乎為全層染色且染色程度較強,在對應的耳后正常皮膚組織中主要表現(xiàn)為基底層細胞的染色。膽脂瘤和耳后皮膚兩組之間陽性染色率的比較具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。5、在人角質(zhì)形成細胞中,上調(diào)miR-203a的表達時Bmi1的m RNA和蛋白的表達量均顯著減少,而當下調(diào)miR-203a的表達時Bmi1的mRNA和蛋白含量則顯著增加(P0.05)。6、經(jīng)過預測和驗證Bmi1是miR203a下游的靶基因。7、為了模擬膽脂瘤中miR-203a的低表達,我們在人角質(zhì)形成細胞中轉染miR-203a抑制劑,發(fā)現(xiàn)可以顯著提高Bmi1的表達,而當共轉染mi R-203a inhibitor和Bmi1 siRNA時,細胞中Bmi1的表達則幾乎下降到對照組細胞的水平。8、細胞增殖MTS實驗結果顯示,當抑制角質(zhì)形成細胞中miR-203a的表達時,細胞的增殖能力顯著增強;而當共轉染miR-203a inhibitor和Bmi1 siRNA后,細胞的增殖能力則幾乎下降到對照組水平。9、細胞集落克隆實驗結果顯示,當抑制角質(zhì)形成細胞中miR-203a表達時,細胞集落形成明顯;當共轉染miR-203a inhibitor和Bmi1 si RNA后,細胞的集落形成能力則幾乎恢復到對照組水平。10、細胞周期結果顯示,當抑制角質(zhì)形成細胞中miR-203a表達時,S期細胞所占的百分比增加,而G1期細胞所占的百分比減少;當共轉染miR-203a inhibitor和Bmi1 siRNA時,S期和Gl期細胞所占的百分比則幾乎恢復到對照組細胞水平。11、細胞凋亡檢測結果顯示,抑制角質(zhì)形成細胞中miR-203a的表達可以顯著降低早期凋亡細胞所占比例;當共轉染miR-203a inhibitor和Bmi1 si RNA時,凋亡細胞的數(shù)量則幾乎恢復到對照組細胞水平。12、細胞遷移實驗結果顯示,抑制角質(zhì)形成細胞中miR-203a的表達能夠有效促進角質(zhì)形成細胞的遷移;而當共轉染miR-203a inhibitor和Bmi1 siRNA時,細胞遷移的能力則幾乎恢復到對照組細胞水平。13、Western blot結果顯示,p-Akt在膽脂瘤上皮中的表達要高于其對應的耳后正常皮膚組織,兩者之間的差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),并且在膽脂瘤中,p-Akt的表達與Bmi1的表達呈顯著正相關(P0.05)。14、免疫組化結果顯示p-Akt在膽脂瘤中主要表現(xiàn)為細胞漿染色,從基底層到基底上層幾乎全層均有染色;p-Akt在耳后正常皮膚組織中多為基底層細胞的胞漿染色。膽脂瘤和耳后皮膚兩組之間染色陽性率的比較有統(tǒng)計學差異(P0.05)。15、在膽脂瘤組織中Bmi1和p-Akt蛋白免疫組化陽性染色之間呈顯著的正相關性(P0.05)。16、western blot檢測結果顯示,在轉染了Bmi1 siRNA的人角質(zhì)形成細胞中,Bmi1和p-Akt的表達均明顯下降(P0.05),當共轉染Bmi1 siRNA和mi R-203a inhibitor時Bmi1和p-Akt的表達得到了恢復。結論:1、通過對miR-203a、miR-34a和miR125a三種miRNAs的檢測發(fā)現(xiàn)與耳后正常皮膚組織相比miR-203a在膽脂瘤組織中的表達明顯下降。2、膽脂瘤中miR-203a的表達量與患者自身的各項臨床特征無明顯相關性。3、Bmi1蛋白在膽脂瘤中的表達升高,并與miR-203a的表達呈負相關。4、Bmi1是miR-203a下游的一個靶基因,并且受miR-203a的負向調(diào)控。5、膽脂瘤中miR-203a表達的下降減弱了對Bmi1的抑制作用,引起了膽脂瘤上皮細胞的過度增殖。6、抑制miR-203a通過上調(diào)Bmi1的表達促進人角質(zhì)形成細胞的增殖、克隆和遷移能力,并抑制細胞凋亡。7、相比于正常皮膚組織p-Akt在膽脂瘤中呈現(xiàn)高表達,且與Bmi1的表達呈正向關。8、在人角質(zhì)形成細胞中miR-203a通過靶向控制Bmi1來影響p-Akt的表達。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R764.21
【圖文】：

19圖2 miR-203a和Bmi1蛋白在20對有自身對照的膽脂瘤及其對應的耳后正常皮膚中的表達情況及相關性的分析A：real-time PCR檢測miR-203a在20對膽脂瘤組織及其對應的耳后正常皮膚組織中的表達情況的柱狀圖（每對標本3個復孔檢測結果比較，* P <0.05）。B：western blot 檢測 Bmi1 蛋白在 20 對膽脂瘤組織及其對應的耳后正常皮膚組織中的表達情況（C：膽脂瘤，S：對應的耳后皮膚）。C：20 對膽脂瘤及其對應的耳后正常皮膚中 miR-203a 表達量的分析比較結果，* P <0.05。D：20 對膽脂瘤及其對應的耳后正常皮膚中 Bmi1 蛋白表達量的分析比較結果，* P <0.05。E：miR-203a 與 Bmi1 在 20 例膽脂瘤組織中表達情況的 Pearson 相關性分析結果。

圖3 Bmi1在膽脂瘤和耳后正常皮膚組織中的免疫組化染色結果（×400）A：膽脂瘤組織中 Bmi1 的表達情況。B：耳后正常皮膚組織中 Bmi1 的表達情況。表 2 Bmi1 蛋白在 20 對膽脂瘤和耳后正常皮膚中染色陽性率的比較指標 膽脂瘤（陽性率） 耳后皮膚（陽性率） χ2P 值Bmi1 80%（16/20） 35%（7/20） 8.286 0.0043.4 miR-203a 靶基因 Bmi1 的預測和鑒定結果我們通過使用 TargetScan、miRanda 等生物信息學預測軟件分析發(fā)現(xiàn) Bmi1 的3’UTR 區(qū)域存在一個與 miR-203a 的結合位點（圖 4A），并且此位點在不同物種間非常保守，在人、黑猩猩、恒河猴、松鼠、兔、豬、牛、貓等多種物種間的互補序列均一致。為了驗證 Bmi1 的表達受 miR-203a 的調(diào)控，我們在人角質(zhì)形成細胞（HaCaT 細胞）中分別轉染 NC miR-mimics、miR-203a mimics、NC miR-inhibitor

37圖 1 抑制 miR-203a 對人角質(zhì)形成細胞中 Bmi1 蛋白的表達以及細胞生物學行為的影響A：western blot檢測轉染NC miR-inhibitor、miR-203a inhibitor以及共轉miR-203a inhibitor+Bmi1siRNA時，Bmi1蛋白的表達情況。B：western blot檢測轉染NC miR-inhibitor、miR-203a inhibitor以及共轉miR-203a inhibitor+Bmi1siRNA時，Bmi1蛋白的相對表達水平，* P<0.05。C：western blot檢測人角質(zhì)形成細胞中轉染Bmi1 siRNA的干擾效率。D：細胞增殖MTS法檢測轉染NC miR-inhibitor、miR-203a inhibitor以及共轉染

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 Feng-Lan Gao;Wei-Shan Li;Chun-Ling Liu;Guo-Qiang Zhao;;Silencing Bmi-1 enhances the senescence and decreases the metastasis of human gastric cancer cells[J];World Journal of Gastroenterology;2013年46期

本文編號：2789098