【摘要】：目的:中耳膽脂瘤是由角化鱗狀上皮在顳骨內(nèi)異常生長而形成的一種界限清楚的囊性病變,由它引起的膽脂瘤型中耳炎是耳鼻咽喉科的常見疾病。像腫瘤一樣膽脂瘤上皮細(xì)胞具有高度的增殖活性,盡管目前研究膽脂瘤病理機(jī)制的方向很多,爭議也很多,然而沒有一種學(xué)說理論能夠完整的解釋膽脂瘤的所有臨床特征,但膽脂瘤上皮細(xì)胞具有高度的增殖活性被認(rèn)為是該病的基本特征。miRNAs參與了包括增殖、分化、凋亡和遷移等一系列重要的生命進(jìn)程,具有廣泛而重要的生物功能。特別是很多miRNAs對腫瘤的生長、遷移和侵襲具有抑制作用,發(fā)揮著抑癌功能,更是成為研究的熱點(diǎn)。miR-203a具有上皮組織特異性,是影響上皮細(xì)胞生長、分化以及功能的重要分子,并在上皮源性腫瘤中發(fā)揮著防癌、抑癌的作用。同時,miR-203a是調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和定向分化的關(guān)鍵因子,它的出現(xiàn)抑制了細(xì)胞的干性,使細(xì)胞停止增殖,開始定向分化。通過生物信息學(xué)軟件分析,我們發(fā)現(xiàn)人類Bmi1基因是miR-203a的預(yù)測靶基因。Bmi1歸屬于是Polycomb家族,是具有遺傳修飾作用的轉(zhuǎn)錄抑制因子,主要通過改變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)來沉默相關(guān)基因的表達(dá)。它在人體多數(shù)組織和大量惡性腫瘤中均有表達(dá),在維持正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的干性和自我更新方面起著至關(guān)重要的作用。膽脂瘤因?yàn)橐簿哂邪ó惓５脑鲋�、遷移和侵襲等很多類似腫瘤的特性,所以我們推測發(fā)揮抑癌作用的miRNAs在膽脂瘤中的表達(dá)可能會有變化。目前,國內(nèi)外關(guān)于miRNAs在膽脂瘤中的報道比較少見,而對于起到調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖分化作用的miR-203a及其預(yù)測靶基因——維持細(xì)胞干性的Bmi1在膽脂瘤中的報道更是沒有出現(xiàn)過。我們通過檢測miR-34a、miR-125a和mi R-203a三種常見的起抑癌作用miRNAs在膽脂瘤和耳后正常皮膚中的表達(dá)情況,篩查出mi R203a在膽脂瘤中的表達(dá)明顯低于耳后正常皮膚,緊接著分析miR-203a在膽脂瘤中的表達(dá)量與膽脂瘤的臨床類型等特征是否具有相關(guān)性。我們預(yù)測了miR203a的靶基因Bmi1,并通過檢測Bmi1在膽脂瘤及其對應(yīng)的耳后正常皮膚中的表達(dá)和分布情況,分析這種表達(dá)是否存在差異,同時分析Bmi1在膽脂瘤中表達(dá)與miR-203a的表達(dá)是否有相關(guān)性。最終通過雙熒光素酶活性檢測分析和在人角質(zhì)形成細(xì)胞中的調(diào)控實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證它們的靶向關(guān)系是否成立。為了模擬膽脂瘤中miR-203a的表達(dá)下調(diào),我們在人角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-203a抑制劑,檢測細(xì)胞的生物學(xué)行為是否朝著膽脂瘤的方向發(fā)展。目前已經(jīng)有很多研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤中Bmi1能夠通過提高Akt的磷酸化水平,進(jìn)而調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。同時,也有相關(guān)研究證實(shí)Akt的磷酸化水平升高也存在于膽脂瘤當(dāng)中。因此我們檢測膽脂瘤中p-Akt蛋白的表達(dá)情況以及與Bmi1的表達(dá)是否相關(guān),最后在角質(zhì)形成細(xì)胞中驗(yàn)證miR-203a能否通過調(diào)節(jié)Bmi1來影響p-Akt的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路的活性。目前國內(nèi)外尚無報道m(xù)iR-203a和Bmi1在膽脂瘤中表達(dá)情況以及調(diào)節(jié)機(jī)制的研究,希望本研究能為日后更深入的探索膽脂瘤發(fā)病機(jī)制的提供一定的幫助,為該病的預(yù)防和診治提供一個新的方向。研究方法:研究對象和實(shí)驗(yàn)材料:共計56例膽脂瘤標(biāo)本和28例耳后皮膚標(biāo)本,其中有20對膽脂瘤標(biāo)本和耳后皮膚標(biāo)本取材自同一患者,為自身對照�；颊呷朐汉笫占ㄐ詣e、年齡、病程、臨床分型、是否首發(fā)、有無并發(fā)癥等臨床信息。所有患者均經(jīng)臨床和病理檢查證實(shí)為后天性中耳膽脂瘤的患者。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為人永生角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞),在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,37℃,5%CO2的條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)方法:1、采用實(shí)時熒光定量PCR檢測miR-203a、miR-34a和mi R125a在膽脂瘤組織和耳后正常皮膚組織中的表達(dá)情況。2、運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR和western blot分別檢測miR-203a和Bmi1在膽脂瘤組織中和與其對應(yīng)的耳后正常皮膚組織中的表達(dá)情況。3、免疫組織化學(xué)染色觀察Bmi1在膽脂瘤和耳后正常皮膚組織中的表達(dá)和分布情況。4、人永生角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)培養(yǎng)。5、采用瞬時轉(zhuǎn)染將NC miR-mimics、miR-203a mimics、NC mi R-inhibitor和miR-203a inhibitor分別轉(zhuǎn)染到HaCaT細(xì)胞中,應(yīng)用real-time PCR和western blot檢測Bmi1在各組細(xì)胞中mRNA和蛋白的表達(dá)水平。6、雙熒光素酶基因報告檢測分析miR-203a和Bmi1的靶向關(guān)系。7、采用瞬時轉(zhuǎn)染將NC mi R-inhibitor、miR-203a inhibitor、Bmi1 siRNA、NC siRNA以及miR-203a inhibitor+Bmi1 siRNA轉(zhuǎn)染到各組人角質(zhì)形成細(xì)胞中,western blot檢測轉(zhuǎn)染效率,并培養(yǎng)24-48小時為后續(xù)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。8、采用細(xì)胞集落克隆實(shí)驗(yàn)檢測各組人角質(zhì)形成細(xì)胞的集落形成能力。9、細(xì)胞增殖MTS實(shí)驗(yàn)檢測各組人角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖情況。10、使用流式細(xì)胞儀對各組人角質(zhì)形成細(xì)胞周期進(jìn)程的變化進(jìn)行檢測。11、使用流式細(xì)胞儀對各組人角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行凋亡發(fā)生率的檢測。12、人角質(zhì)形成細(xì)胞遷移能力的檢測使用Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。13、使用Western blot檢測膽脂瘤和耳后皮膚組織中p-Akt蛋白的表達(dá)情況。14、應(yīng)用免疫組化染色檢測p-Akt在膽脂瘤和皮膚組織中的表達(dá)和分布情況。15、Western blot檢測不同轉(zhuǎn)染組的人角質(zhì)形成細(xì)胞中Bmi1、Total-Akt和p-Akt的表達(dá)情況。結(jié)果:1、real-time PCR檢測結(jié)果顯示miR-203a在膽脂瘤中的表達(dá)顯著低于耳后正常皮膚組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。miR-34a和miR125a在膽脂瘤和耳后正常皮膚中的表達(dá)無顯著差異。2、miR-203a在膽脂瘤中的表達(dá)量與患者的性別、年齡、病史長短、是否首發(fā)、有無并發(fā)癥以及膽脂瘤的分型等臨床特征均無明顯相關(guān)性(P0.05)。3、在20例有自身對照的膽脂瘤患者中,miR-203a在膽脂瘤中的表達(dá)均顯著低于其對應(yīng)的耳后正常皮膚組織,相反Bmi1蛋白在膽脂瘤中的表達(dá)則明顯高于其對應(yīng)的皮膚組織,person相關(guān)分析結(jié)果顯示二者之間存在顯著的負(fù)相關(guān)(P0.05)。4、免疫組織化學(xué)顯示Bmi1主要為細(xì)胞核染色,在膽脂瘤上皮中幾乎為全層染色且染色程度較強(qiáng),在對應(yīng)的耳后正常皮膚組織中主要表現(xiàn)為基底層細(xì)胞的染色。膽脂瘤和耳后皮膚兩組之間陽性染色率的比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。5、在人角質(zhì)形成細(xì)胞中,上調(diào)miR-203a的表達(dá)時Bmi1的m RNA和蛋白的表達(dá)量均顯著減少,而當(dāng)下調(diào)miR-203a的表達(dá)時Bmi1的mRNA和蛋白含量則顯著增加(P0.05)。6、經(jīng)過預(yù)測和驗(yàn)證Bmi1是miR203a下游的靶基因。7、為了模擬膽脂瘤中miR-203a的低表達(dá),我們在人角質(zhì)形成細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-203a抑制劑,發(fā)現(xiàn)可以顯著提高Bmi1的表達(dá),而當(dāng)共轉(zhuǎn)染mi R-203a inhibitor和Bmi1 siRNA時,細(xì)胞中Bmi1的表達(dá)則幾乎下降到對照組細(xì)胞的水平。8、細(xì)胞增殖MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)抑制角質(zhì)形成細(xì)胞中miR-203a的表達(dá)時,細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng);而當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-203a inhibitor和Bmi1 siRNA后,細(xì)胞的增殖能力則幾乎下降到對照組水平。9、細(xì)胞集落克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)抑制角質(zhì)形成細(xì)胞中miR-203a表達(dá)時,細(xì)胞集落形成明顯;當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-203a inhibitor和Bmi1 si RNA后,細(xì)胞的集落形成能力則幾乎恢復(fù)到對照組水平。10、細(xì)胞周期結(jié)果顯示,當(dāng)抑制角質(zhì)形成細(xì)胞中miR-203a表達(dá)時,S期細(xì)胞所占的百分比增加,而G1期細(xì)胞所占的百分比減少;當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-203a inhibitor和Bmi1 siRNA時,S期和Gl期細(xì)胞所占的百分比則幾乎恢復(fù)到對照組細(xì)胞水平。11、細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示,抑制角質(zhì)形成細(xì)胞中miR-203a的表達(dá)可以顯著降低早期凋亡細(xì)胞所占比例;當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-203a inhibitor和Bmi1 si RNA時,凋亡細(xì)胞的數(shù)量則幾乎恢復(fù)到對照組細(xì)胞水平。12、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,抑制角質(zhì)形成細(xì)胞中miR-203a的表達(dá)能夠有效促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移;而當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-203a inhibitor和Bmi1 siRNA時,細(xì)胞遷移的能力則幾乎恢復(fù)到對照組細(xì)胞水平。13、Western blot結(jié)果顯示,p-Akt在膽脂瘤上皮中的表達(dá)要高于其對應(yīng)的耳后正常皮膚組織,兩者之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),并且在膽脂瘤中,p-Akt的表達(dá)與Bmi1的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P0.05)。14、免疫組化結(jié)果顯示p-Akt在膽脂瘤中主要表現(xiàn)為細(xì)胞漿染色,從基底層到基底上層幾乎全層均有染色;p-Akt在耳后正常皮膚組織中多為基底層細(xì)胞的胞漿染色。膽脂瘤和耳后皮膚兩組之間染色陽性率的比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。15、在膽脂瘤組織中Bmi1和p-Akt蛋白免疫組化陽性染色之間呈顯著的正相關(guān)性(P0.05)。16、western blot檢測結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染了Bmi1 siRNA的人角質(zhì)形成細(xì)胞中,Bmi1和p-Akt的表達(dá)均明顯下降(P0.05),當(dāng)共轉(zhuǎn)染Bmi1 siRNA和mi R-203a inhibitor時Bmi1和p-Akt的表達(dá)得到了恢復(fù)。結(jié)論:1、通過對miR-203a、miR-34a和miR125a三種miRNAs的檢測發(fā)現(xiàn)與耳后正常皮膚組織相比miR-203a在膽脂瘤組織中的表達(dá)明顯下降。2、膽脂瘤中miR-203a的表達(dá)量與患者自身的各項(xiàng)臨床特征無明顯相關(guān)性。3、Bmi1蛋白在膽脂瘤中的表達(dá)升高,并與miR-203a的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。4、Bmi1是miR-203a下游的一個靶基因,并且受miR-203a的負(fù)向調(diào)控。5、膽脂瘤中miR-203a表達(dá)的下降減弱了對Bmi1的抑制作用,引起了膽脂瘤上皮細(xì)胞的過度增殖。6、抑制miR-203a通過上調(diào)Bmi1的表達(dá)促進(jìn)人角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、克隆和遷移能力,并抑制細(xì)胞凋亡。7、相比于正常皮膚組織p-Akt在膽脂瘤中呈現(xiàn)高表達(dá),且與Bmi1的表達(dá)呈正向關(guān)。8、在人角質(zhì)形成細(xì)胞中miR-203a通過靶向控制Bmi1來影響p-Akt的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R764.21
【圖文】：

19圖2 miR-203a和Bmi1蛋白在20對有自身對照的膽脂瘤及其對應(yīng)的耳后正常皮膚中的表達(dá)情況及相關(guān)性的分析A：real-time PCR檢測miR-203a在20對膽脂瘤組織及其對應(yīng)的耳后正常皮膚組織中的表達(dá)情況的柱狀圖（每對標(biāo)本3個復(fù)孔檢測結(jié)果比較，* P <0.05）。B：western blot 檢測 Bmi1 蛋白在 20 對膽脂瘤組織及其對應(yīng)的耳后正常皮膚組織中的表達(dá)情況（C：膽脂瘤，S：對應(yīng)的耳后皮膚）。C：20 對膽脂瘤及其對應(yīng)的耳后正常皮膚中 miR-203a 表達(dá)量的分析比較結(jié)果，* P <0.05。D：20 對膽脂瘤及其對應(yīng)的耳后正常皮膚中 Bmi1 蛋白表達(dá)量的分析比較結(jié)果，* P <0.05。E：miR-203a 與 Bmi1 在 20 例膽脂瘤組織中表達(dá)情況的 Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果。

圖3 Bmi1在膽脂瘤和耳后正常皮膚組織中的免疫組化染色結(jié)果（×400）A：膽脂瘤組織中 Bmi1 的表達(dá)情況。B：耳后正常皮膚組織中 Bmi1 的表達(dá)情況。表 2 Bmi1 蛋白在 20 對膽脂瘤和耳后正常皮膚中染色陽性率的比較指標(biāo) 膽脂瘤（陽性率） 耳后皮膚（陽性率） χ2P 值Bmi1 80%（16/20） 35%（7/20） 8.286 0.0043.4 miR-203a 靶基因 Bmi1 的預(yù)測和鑒定結(jié)果我們通過使用 TargetScan、miRanda 等生物信息學(xué)預(yù)測軟件分析發(fā)現(xiàn) Bmi1 的3’UTR 區(qū)域存在一個與 miR-203a 的結(jié)合位點(diǎn)（圖 4A），并且此位點(diǎn)在不同物種間非常保守，在人、黑猩猩、恒河猴、松鼠、兔、豬、牛、貓等多種物種間的互補(bǔ)序列均一致。為了驗(yàn)證 Bmi1 的表達(dá)受 miR-203a 的調(diào)控，我們在人角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT 細(xì)胞）中分別轉(zhuǎn)染 NC miR-mimics、miR-203a mimics、NC miR-inhibitor

37圖 1 抑制 miR-203a 對人角質(zhì)形成細(xì)胞中 Bmi1 蛋白的表達(dá)以及細(xì)胞生物學(xué)行為的影響A：western blot檢測轉(zhuǎn)染NC miR-inhibitor、miR-203a inhibitor以及共轉(zhuǎn)miR-203a inhibitor+Bmi1siRNA時，Bmi1蛋白的表達(dá)情況。B：western blot檢測轉(zhuǎn)染NC miR-inhibitor、miR-203a inhibitor以及共轉(zhuǎn)miR-203a inhibitor+Bmi1siRNA時，Bmi1蛋白的相對表達(dá)水平，* P<0.05。C：western blot檢測人角質(zhì)形成細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Bmi1 siRNA的干擾效率。D：細(xì)胞增殖MTS法檢測轉(zhuǎn)染NC miR-inhibitor、miR-203a inhibitor以及共轉(zhuǎn)染

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Feng-Lan Gao;Wei-Shan Li;Chun-Ling Liu;Guo-Qiang Zhao;;Silencing Bmi-1 enhances the senescence and decreases the metastasis of human gastric cancer cells[J];World Journal of Gastroenterology;2013年46期

本文編號：2789098