【摘要】：目的：建立H_2O_2誘導(dǎo)的小鼠TKE2細(xì)胞和角膜氧化應(yīng)激的體內(nèi)外模型，通過添加ROCK抑制劑Y-27632，研究Y-27632對(duì)角膜上皮的保護(hù)性作用及其機(jī)制。 方法：（1）應(yīng)用小鼠角膜上皮干/祖細(xì)胞系（TKE2）作為細(xì)胞模型，用無BPE(牛垂體提取物)的培養(yǎng)基處理2小時(shí)，而后用含Y-27632的培養(yǎng)基預(yù)干預(yù)2小時(shí)，再用200μM H_2O_2處理2小時(shí)，24小時(shí)后檢測細(xì)胞內(nèi)ROS（活性氧自由基）水平、細(xì)胞增殖以及NOX4、NRF2的表達(dá)情況；收集細(xì)胞提取mRNA，定量PCR檢測NRF2下游基因的表達(dá)情況；（2）選擇6-8周齡Balb/C小鼠，隨機(jī)分為4組，1組為對(duì)照組，另外3組采用5μl500μM H_2O_2角膜局部處理30分鐘，而后分別采用PBS（磷酸鹽緩沖液）、BSA（牛血清白蛋白）或Y-27632進(jìn)行干預(yù)；一組4小時(shí)后取材，二組12小時(shí)后再次給予PBS、BSA或Y-27632干預(yù)，24小時(shí)后取材，分別行ROS、TUNEL、NOX4、NRF2的免疫熒光染色及H.E染色。 結(jié)果：Y-27632干預(yù)可以顯著抑制H_2O_2誘導(dǎo)的小鼠TKE2細(xì)胞和小鼠角膜的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并呈現(xiàn)典型的時(shí)間效應(yīng)。作用機(jī)制包括以下幾點(diǎn)：（1）Y-27632通過抑制H_2O_2誘導(dǎo)的NOX4的表達(dá)上調(diào)，降低了細(xì)胞在H_2O_2誘導(dǎo)下ROS水平的過度累積（；2）Y-27632抑制了H_2O_2誘導(dǎo)的NRF2通路的活化，以及下游HO-1、NQO-1、catalase等因子的過度表達(dá)，從而避免了NRF2信號(hào)通路過度活化引起的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。 結(jié)論：ROCK抑制劑Y-27632主要通過抑制NOX4表達(dá)和NRF2信號(hào)通路過度活化，降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，從而起到保護(hù)角膜上皮細(xì)胞的作用。
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R772.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 董曉光,謝立信,張新晨,史偉云,李偉,袁風(fēng)波;角膜中期保存液的研制和臨床應(yīng)用[J];中華眼科雜志;2000年01期

本文編號(hào)：2787204