【摘要】：研究背景:鼻咽癌是來源于鼻咽上皮的惡性腫瘤,好發(fā)于鼻咽腔頂部、側壁及咽隱窩,是我國南方的高發(fā)惡性腫瘤之一。鼻咽癌的流行病學呈明顯的地域分布特征,在我國的華南地區(qū),其發(fā)病率高達15-30/100,000(人/年)。鼻咽癌病因復雜,目前認為與EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)感染、環(huán)境因素、種族易感性及遺傳因素密切相關。由于鼻咽部解剖結構復雜、部位特殊,腫瘤細胞對放射線中度敏感,所以放射治療一直是鼻咽癌的首選治療方式。近年來,隨著診斷水平、放射治療技術和多學科綜合治療的發(fā)展,鼻咽癌的療效已獲得大幅提高。目前鼻咽癌治療的失敗原因不僅是治療后局部復發(fā),還有治療前或治療后的遠處轉移。因此,研究鼻咽癌相關的分子機制,尋找新的治療靶點是鼻咽癌治療的未來方向。鐵參與多種體內生命代謝過程,包括DNA合成、氧運輸、三羧酸循環(huán)等,促進細胞的增殖、侵襲。腫瘤細胞被證實可以通過調節(jié)相關蛋白的表達,增加鐵攝入,降低細胞內貯存鐵的含量,使更多的鐵參與腫瘤細胞的代謝,維持腫瘤細胞的生長。3-羥基丁酸脫氫酶2(BDH2)基因位于人類染色體4q24,參與人體酮體代謝,同時還通過催化哺乳動物鐵載體結合不穩(wěn)定鐵,調控細胞內的鐵穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現鐵代謝是腫瘤治療的靶點,而鐵螯合劑藥物在腫瘤治療日益廣泛的運用。目前,BDH2和鐵代謝與鼻咽癌的研究甚少,因此,本研究中我們探索了BDH2在鼻咽癌中的表達情況,探究其對鼻咽癌惡性生物學行為的影響,從鐵代謝角度研究深入了解了鼻咽癌的相關分子機制。研究目的:探索BDH2基因在鼻咽癌中的表達及其對鼻咽癌惡性生物學行為的影響;探究BDH2基因調控鐵代謝影響鼻咽癌增殖和侵襲的可能分子機制。研究方法:1.通過熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time RT-PCR)、蛋白免疫印跡(Western blot)法及免疫組織化學染色法(Immunohistochemistry)驗證BDH2基因在鼻咽癌中的轉錄和蛋白的表達情況。2.用脂質體轉染法構建外源性穩(wěn)定過表達BDH2基因的鼻咽癌細胞系,通過MTT比色法檢測增殖曲線、克隆形成實驗、裸鼠成瘤實驗驗證BDH2對鼻咽癌細胞增殖的影響。3.利用基因芯片(Microarray)技術檢測外源性穩(wěn)定過表達BDH2基因的鼻咽癌細胞基因表達譜情況,并運用GCBI(Gene Cloud of Biotechnology Information)數據平臺分析測序數據結果。4.通過細胞劃痕實驗以及細胞侵襲實驗驗證BDH2基因對鼻咽癌細胞惡性生物學行為的影響,同時利用Western blot方法驗證基因芯片分析結果,確定侵襲相關因子E-Cadherin,Vimintin,β-Catenin,SPARC,EPCAM的表達,評價BDH2基因對鼻咽癌遷移和侵襲的影響,闡明其分子機制。5.通過鐵離子檢測試劑盒檢測過表達BDH2鼻咽癌細胞內鐵離子含量。6.利用不同濃度外源性鐵離子(Fe2+)及游離鐵螯合劑(Deferoxamine,DFX)處理鼻咽癌細胞系,通過MTT增殖實驗、2D細胞劃痕實驗及3D細胞侵襲實驗,檢測鐵離子對鼻咽癌細胞惡性生物學行為的影響。研究結果:1.BDH2基因在鼻咽癌細胞和組織中低表達首先通過實時熒光定量PCR方法檢測BDH2基因在鼻咽癌細胞(HONE1、HK1、CNE1、CNE2、TW03、5-8F)的轉錄水平,與正常鼻咽上皮細胞系(NP460、NP69)相比,BDH2基因在鼻咽癌細胞系中轉錄水平下調;進一步使用實時熒光定量PCR和免疫組織化學技術驗證鼻咽癌組織中BDH2的轉錄和表達情況,結果顯示BDH2在鼻咽癌組織中的轉錄和表達水平明顯低于正常鼻咽組織(P0.05)。2.外源性表達BDH2基因抑制鼻咽癌細胞增殖構建過表達BDH2基因鼻咽癌穩(wěn)轉細胞系,并通過Real time RT-PCR及Western blot對穩(wěn)轉細胞系進行驗證。后通過MTT細胞增殖實驗、克隆形成及裸鼠成瘤實驗評估BDH2基因對鼻咽癌細胞的影響,結果發(fā)現轉染BDH2的鼻咽癌細胞生長速度較對照組細胞降低,提示外源性表達BDH2基因可以抑制鼻咽癌細胞的增殖。3.BDH2基因改變鼻咽癌細胞侵襲相關基因表達,抑制鼻咽癌細胞侵襲通過基因芯片技術檢測過表達BDH2穩(wěn)定轉染鼻咽癌細胞系,發(fā)現與對照組細胞系相比,轉染BDH2細胞中與侵襲相關基因E-Cadherin,EPCAM表達上調,Vimintin,β-Catenin,SPARC發(fā)生下調。通過細胞劃痕和Transwell體外侵襲實驗驗證BDH2基因對鼻咽癌細胞的影響,結果顯示,BDH2可以抑制鼻咽癌侵襲能力。通過實時熒光定量PCR和Western blot檢測鼻咽癌細胞系中E-Cadherin,EPCAM,β-Catenin,SPARC的表達,結果發(fā)現,與對照組相比,β-Catenin、Vimentin、SPARC表達下降,E-cadherin表達升高。提示過表達BDH2基因通過改變上皮間質-轉化(EMT)相關基因抑制鼻咽癌細胞的侵襲能力。4.BDH2通過減少鐵離子含量抑制鼻咽癌細胞的增殖、遷移與侵襲通過鐵離子檢測試劑盒發(fā)現過表達BDH2的鼻咽癌細胞中鐵離子含量降低,MTT細胞增殖實驗發(fā)現鼻咽癌細胞增殖速度隨著鐵螯合劑濃度升高而降低,成反比關系;補充鐵離子可以恢復經鐵螯合劑處理后鼻咽癌細胞的增殖能力。通過細胞劃痕實驗及Transwell細胞侵襲實驗發(fā)現鐵促進鼻咽癌細胞遷移與侵襲。提示BDH2可以通過減少鐵離子含量抑制鼻咽癌細胞增殖、遷移與侵襲能力。研究結論:1.BDH2在鼻咽癌細胞和組織中轉錄和表達下調;2.過表達BDH2基因可抑制鼻咽癌細胞的增殖能力、遷移能力和侵襲能力;3.BDH2基因通過調節(jié)細胞內鐵離子水平進而抑制鼻咽癌細胞增殖、侵襲和遷移。綜上提示,BDH2基因可能是鼻咽癌的一個候選的抑癌基因。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.63

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