【摘要】：研究背景:鼻咽癌是來(lái)源于鼻咽上皮的惡性腫瘤,好發(fā)于鼻咽腔頂部、側(cè)壁及咽隱窩,是我國(guó)南方的高發(fā)惡性腫瘤之一。鼻咽癌的流行病學(xué)呈明顯的地域分布特征,在我國(guó)的華南地區(qū),其發(fā)病率高達(dá)15-30/100,000(人/年)。鼻咽癌病因復(fù)雜,目前認(rèn)為與EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)感染、環(huán)境因素、種族易感性及遺傳因素密切相關(guān)。由于鼻咽部解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜、部位特殊,腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線中度敏感,所以放射治療一直是鼻咽癌的首選治療方式。近年來(lái),隨著診斷水平、放射治療技術(shù)和多學(xué)科綜合治療的發(fā)展,鼻咽癌的療效已獲得大幅提高。目前鼻咽癌治療的失敗原因不僅是治療后局部復(fù)發(fā),還有治療前或治療后的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此,研究鼻咽癌相關(guān)的分子機(jī)制,尋找新的治療靶點(diǎn)是鼻咽癌治療的未來(lái)方向。鐵參與多種體內(nèi)生命代謝過(guò)程,包括DNA合成、氧運(yùn)輸、三羧酸循環(huán)等,促進(jìn)細(xì)胞的增殖、侵襲。腫瘤細(xì)胞被證實(shí)可以通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá),增加鐵攝入,降低細(xì)胞內(nèi)貯存鐵的含量,使更多的鐵參與腫瘤細(xì)胞的代謝,維持腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。3-羥基丁酸脫氫酶2(BDH2)基因位于人類(lèi)染色體4q24,參與人體酮體代謝,同時(shí)還通過(guò)催化哺乳動(dòng)物鐵載體結(jié)合不穩(wěn)定鐵,調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的鐵穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)鐵代謝是腫瘤治療的靶點(diǎn),而鐵螯合劑藥物在腫瘤治療日益廣泛的運(yùn)用。目前,BDH2和鐵代謝與鼻咽癌的研究甚少,因此,本研究中我們探索了BDH2在鼻咽癌中的表達(dá)情況,探究其對(duì)鼻咽癌惡性生物學(xué)行為的影響,從鐵代謝角度研究深入了解了鼻咽癌的相關(guān)分子機(jī)制。研究目的:探索BDH2基因在鼻咽癌中的表達(dá)及其對(duì)鼻咽癌惡性生物學(xué)行為的影響;探究BDH2基因調(diào)控鐵代謝影響鼻咽癌增殖和侵襲的可能分子機(jī)制。研究方法:1.通過(guò)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time RT-PCR)、蛋白免疫印跡(Western blot)法及免疫組織化學(xué)染色法(Immunohistochemistry)驗(yàn)證BDH2基因在鼻咽癌中的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)情況。2.用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法構(gòu)建外源性穩(wěn)定過(guò)表達(dá)BDH2基因的鼻咽癌細(xì)胞系,通過(guò)MTT比色法檢測(cè)增殖曲線、克隆形成實(shí)驗(yàn)、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證BDH2對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響。3.利用基因芯片(Microarray)技術(shù)檢測(cè)外源性穩(wěn)定過(guò)表達(dá)BDH2基因的鼻咽癌細(xì)胞基因表達(dá)譜情況,并運(yùn)用GCBI(Gene Cloud of Biotechnology Information)數(shù)據(jù)平臺(tái)分析測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果。4.通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證BDH2基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響,同時(shí)利用Western blot方法驗(yàn)證基因芯片分析結(jié)果,確定侵襲相關(guān)因子E-Cadherin,Vimintin,β-Catenin,SPARC,EPCAM的表達(dá),評(píng)價(jià)BDH2基因?qū)Ρ茄拾┻w移和侵襲的影響,闡明其分子機(jī)制。5.通過(guò)鐵離子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)過(guò)表達(dá)BDH2鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)鐵離子含量。6.利用不同濃度外源性鐵離子(Fe2+)及游離鐵螯合劑(Deferoxamine,DFX)處理鼻咽癌細(xì)胞系,通過(guò)MTT增殖實(shí)驗(yàn)、2D細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及3D細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn),檢測(cè)鐵離子對(duì)鼻咽癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。研究結(jié)果:1.BDH2基因在鼻咽癌細(xì)胞和組織中低表達(dá)首先通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)BDH2基因在鼻咽癌細(xì)胞(HONE1、HK1、CNE1、CNE2、TW03、5-8F)的轉(zhuǎn)錄水平,與正常鼻咽上皮細(xì)胞系(NP460、NP69)相比,BDH2基因在鼻咽癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄水平下調(diào);進(jìn)一步使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)技術(shù)驗(yàn)證鼻咽癌組織中BDH2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況,結(jié)果顯示BDH2在鼻咽癌組織中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平明顯低于正常鼻咽組織(P0.05)。2.外源性表達(dá)BDH2基因抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖構(gòu)建過(guò)表達(dá)BDH2基因鼻咽癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,并通過(guò)Real time RT-PCR及Western blot對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證。后通過(guò)MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成及裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)評(píng)估BDH2基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染BDH2的鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)速度較對(duì)照組細(xì)胞降低,提示外源性表達(dá)BDH2基因可以抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖。3.BDH2基因改變鼻咽癌細(xì)胞侵襲相關(guān)基因表達(dá),抑制鼻咽癌細(xì)胞侵襲通過(guò)基因芯片技術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)BDH2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組細(xì)胞系相比,轉(zhuǎn)染BDH2細(xì)胞中與侵襲相關(guān)基因E-Cadherin,EPCAM表達(dá)上調(diào),Vimintin,β-Catenin,SPARC發(fā)生下調(diào)。通過(guò)細(xì)胞劃痕和Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證BDH2基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞的影響,結(jié)果顯示,BDH2可以抑制鼻咽癌侵襲能力。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞系中E-Cadherin,EPCAM,β-Catenin,SPARC的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,β-Catenin、Vimentin、SPARC表達(dá)下降,E-cadherin表達(dá)升高。提示過(guò)表達(dá)BDH2基因通過(guò)改變上皮間質(zhì)-轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)基因抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲能力。4.BDH2通過(guò)減少鐵離子含量抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲通過(guò)鐵離子檢測(cè)試劑盒發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)BDH2的鼻咽癌細(xì)胞中鐵離子含量降低,MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細(xì)胞增殖速度隨著鐵螯合劑濃度升高而降低,成反比關(guān)系;補(bǔ)充鐵離子可以恢復(fù)經(jīng)鐵螯合劑處理后鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力。通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鐵促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞遷移與侵襲。提示BDH2可以通過(guò)減少鐵離子含量抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力。研究結(jié)論:1.BDH2在鼻咽癌細(xì)胞和組織中轉(zhuǎn)錄和表達(dá)下調(diào);2.過(guò)表達(dá)BDH2基因可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力、遷移能力和侵襲能力;3.BDH2基因通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵離子水平進(jìn)而抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。綜上提示,BDH2基因可能是鼻咽癌的一個(gè)候選的抑癌基因。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R739.63

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本文編號(hào)：2785969