【摘要】：青光眼為一種多因素遺傳的視神經(jīng)退行性疾病,以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的丟失、視神經(jīng)杯凹加深和視野缺損為特征,在世界范圍內(nèi)屬于常見的不可逆性的致盲性眼病之一。目前臨床明確診斷青光眼,青光眼的病程已不在早期,青光眼是不可逆的致盲病,所以早期診斷、早期治療具有重大意義。而在現(xiàn)有技術(shù)條件下,診斷早期青光眼存在一定的困難。從分子機(jī)制研究青光眼的發(fā)生發(fā)展,能夠?qū)υ缙谇喙庋圻M(jìn)行診斷,從而早期治療,延緩進(jìn)展,挽救視功能。生物信息學(xué)是一門在生命科學(xué)的研究中,使用計(jì)算機(jī)對生物信息進(jìn)行存儲(chǔ)、檢索和分析的科學(xué)。重點(diǎn)研究基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué),具體來說就是從核酸和蛋白質(zhì)序列出發(fā),分析序列中表達(dá)的結(jié)構(gòu)功能的生物信息。它可以通過對現(xiàn)有的生物芯片海量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、生物聚類和功能分析等,挖掘有用信息,并利用各種圖形化工具將重要的信息可視化,從而認(rèn)識(shí)疾病的分子機(jī)制,豐富我們對疾病的認(rèn)識(shí)。隨著生物信息學(xué)發(fā)展,形成了新的生物學(xué)研究模式,即利用現(xiàn)有的數(shù)據(jù)信息,先做理論推測,再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,最終應(yīng)用到臨床實(shí)踐。本研究課題以GEO和KEGG數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ),采用R軟件中l(wèi)imma包篩選出對照樣本和No or early樣本的差異基因和差異lnc RNA,聯(lián)合生物信息分析軟件和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)挖掘等方法進(jìn)行相互作用關(guān)系分析,從而探索與早期青光眼相關(guān)的基因、lnc RNA,為青光眼發(fā)生的分子機(jī)制研究提供重要信息,為早期青光眼的診斷提供新的思路。第一部分:早期青光眼差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析研究背景:青光眼是我國常見的致盲性眼病之一,根據(jù)目前流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,各類青光眼的總患病率約為0.21%~1.7%之間。一般認(rèn)為青光眼是復(fù)雜的多因素疾病,遺傳因素和環(huán)境因素共同參與了青光眼的發(fā)生和發(fā)展。基因芯片技術(shù)具有高通量、微型化和自動(dòng)化等特點(diǎn),能夠可以對大量的生物樣品平行、快速、敏感、高效地進(jìn)行基因分析,因而在DNA序列測定、基因表達(dá)分析、基因組研究、基因診斷等方面應(yīng)用廣泛。目的:通過對青光眼表達(dá)芯片的生物信息學(xué)分析,篩選出與該疾病相關(guān)的差異表達(dá)基因,對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋、通路分析和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析,為探索青光眼的發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。方法:本研究整理GEO公共數(shù)據(jù)庫的基因芯片數(shù)據(jù)集,以針對青光眼目標(biāo)的Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Array表達(dá)數(shù)據(jù)譜作為研究對象,系統(tǒng)地分析早期青光眼的基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù),進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理,選擇非配對t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法篩選出差異表達(dá)基因,應(yīng)用軟件選取GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋、KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路分析,導(dǎo)入STRING在線數(shù)據(jù)庫繪制差異表達(dá)基因編碼蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖,并用Cytoscape軟件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)及各節(jié)點(diǎn)的拓?fù)涮匦�。結(jié)果:(1)本研究在早期青光眼中發(fā)現(xiàn)920個(gè)基因表達(dá)異常,其中表達(dá)上調(diào)的495個(gè),下調(diào)的425個(gè)。(2)GO分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要集中在免疫、炎癥、補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)、凝血等通路。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn),差異基因主要集中在補(bǔ)體途徑、TNF-α信號(hào)通路、細(xì)胞因子受體相互作用、溶酶體等通路。(3)經(jīng)STRING軟件共篩選出266個(gè)差異表達(dá)基因編碼的蛋白產(chǎn)物存在相互作用,構(gòu)建差異表達(dá)基因互作網(wǎng)絡(luò)圖,Cytoscape軟件共篩選出五個(gè)關(guān)鍵基因,分別為Alb,II4,C3,Anxa1,Gnai2。結(jié)論:(1)成功篩選出早期青光眼中差異表達(dá)的920個(gè)基因,并對其進(jìn)行功能注釋和通路分析,為該疾病的分子機(jī)制研究和實(shí)驗(yàn)室診斷提供了理論基礎(chǔ)。(2)成功構(gòu)建早期青光眼差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò),并篩選出5個(gè)關(guān)鍵基因,提示這些基因可能參與了早期青光眼的發(fā)生和發(fā)展過程,有利于進(jìn)一步研究差異表達(dá)基因的相互作用關(guān)系,并為該疾病的早期診斷和治療提供新的方向。第二部分:早期青光眼差異表達(dá)lnc RNA的生物信息學(xué)分析研究背景:長非編碼RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)雖然很少有編碼蛋白質(zhì)的功能,但是在基因調(diào)控方面發(fā)揮了重要作用,與疾病的發(fā)生息息相關(guān),所以近幾年得到廣泛關(guān)注。既往研究表明lnc RNA與細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)綜復(fù)雜的信號(hào)通路有著千絲萬縷的關(guān)系,但是其發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不十分清楚。因此,目前l(fā)nc RNA在青光眼中的作用和機(jī)制還沒有得到很好的研究。目的:本研究通過生物信息學(xué)方法,分析GEO數(shù)據(jù)庫中的早期青光眼數(shù)據(jù),探索早期青光眼中的差異表達(dá)lnc RNA,為后續(xù)研究lnc RNA在青光眼中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和新的方向。方法:本研究通過對GEO公共數(shù)據(jù)庫的早期青光眼基因芯片數(shù)據(jù)集重新注釋并進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理,選擇非配對t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法篩選差異表達(dá)lnc RNA,使用WGCNA對差異基因和差異lnc RNA構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),使用Cytoscape對共表達(dá)關(guān)系表進(jìn)行圖形化。從共表達(dá)關(guān)系表中,我們選出與lnc RNA具有共表達(dá)關(guān)系的節(jié)點(diǎn),對篩選出的具有多個(gè)功能靶標(biāo)的lnc RNA進(jìn)行GO和KEGG分析。結(jié)果:(1)本部分研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,早期青光眼70個(gè)lnc RNA表達(dá)出現(xiàn)差異。其中上調(diào)39個(gè),表達(dá)下調(diào)31個(gè)。(2)差異基因和差異lnc RNA共有527對共表達(dá)關(guān)系,節(jié)點(diǎn)為Gm13629和1700012D14Rik。(3)對lnc RNA進(jìn)行GO和KEGG分析,篩選出1700012D14Rik和2810002D19Rik這兩個(gè)關(guān)鍵lnc RNA。結(jié)論:(1)成功篩選出早期青光眼中差異表達(dá)的70個(gè)lnc RNA,為進(jìn)一步研究lnc RNA在該疾病中的作用提供了理論基礎(chǔ)和方向。(2)1700012D14Rik和2810002D19Rik可能分別通過調(diào)節(jié)過氧化物酶體生成和調(diào)節(jié)基因的非同源末端連接信號(hào)通路參與早期青光眼的發(fā)生和發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R775
【圖文】：

第一部分 早期青光眼相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析GPL1261 基因芯片平臺(tái)本部分研究對象為 GPL1261 芯片產(chǎn)生的基因數(shù)據(jù)表達(dá)數(shù)據(jù)。GPL1261 芯片平臺(tái)被稱為小鼠基因組 430 2.0 芯片集（Affymetrix 公司生產(chǎn)），此款芯片包含了所有基因芯片小鼠表達(dá)集 430 上的探測集。該基因數(shù)據(jù)庫的序列來自于 GenBank、dbES和 RefSeqUniGene。數(shù)據(jù)集簇來自 UniGene 數(shù)據(jù)庫(2002 年 6 月 107 建立)，然后通過與 Whitehead 基因組研究所( Whitehead Institute for Genome Research，MGSC, 2002 年4 月)的小鼠基因組公開的草案匯編進(jìn)行分析和比較。參見圖 2。

圖 3 DAVID 在線分析KEGG 通路分析KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)[7]，即京都基因和基因組百書，是 1995 年由日本京都大學(xué)化學(xué)研究所教授 Minoru Kanehisa 在當(dāng)時(shí)正在進(jìn)行本人類基因組計(jì)劃下發(fā)起，用于處理基因組，生物途徑，疾病，藥物和化學(xué)物質(zhì)據(jù)庫的集合。它是手動(dòng)繪制的 KEGG 路徑圖的集合，代表了關(guān)于細(xì)胞和生物體謝和各種其他功能的實(shí)驗(yàn)知識(shí)。每個(gè)通路圖都包含一個(gè)分子相互作用和反應(yīng)網(wǎng)在將基因組中的基因與通路中的基因產(chǎn)物連接起來。KEGG 大致分為系統(tǒng)信息、組信息和化學(xué)信息三大類，進(jìn)一步可細(xì)分為 16 個(gè)主要的數(shù)據(jù)庫，可以通過不同色編碼來區(qū)分。在本研究中，我們整理了早期青光眼的差異表達(dá)基因，使用 KOBAS 2.0[8]（圖差異基因進(jìn)行 KEGG 通路富集分析，p<0.05 被作為篩選條件，探索差異表達(dá)基

圖 4 KOBAS 2.0差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵基因的篩選Protein protein interactions (PPIs) 即蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，是由靜電力驅(qū)動(dòng)的生物化學(xué)事件引起的兩個(gè)或更多蛋白質(zhì)分子之間建立的高度特異性的物理接觸。所以蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein protein interaction network，PPI network）信息使得能夠創(chuàng)建與代謝或遺傳/表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)類似的大蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)賦予關(guān)于疾病的生化級(jí)聯(lián)和分子病因?qū)W的當(dāng)前知識(shí)以及發(fā)現(xiàn)具有治療意義的推定蛋白質(zhì)靶標(biāo)。STRING 數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org/，圖 5）[9]是一個(gè)搜索已知蛋白質(zhì)之間和預(yù)測蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫可應(yīng)用于 2031 個(gè)物種，包含 960 萬種蛋白和 1380 萬種蛋白質(zhì)之間的相互作用。STRING 數(shù)據(jù)庫可以幫助發(fā)現(xiàn)與所研究蛋白相互作用的其他蛋白質(zhì)的信息，從而能夠更加深入地認(rèn)清相關(guān)蛋白質(zhì)的功能和理解其調(diào)控機(jī)制。它除了包含有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、從 pubmed 摘要中文本的挖掘結(jié)果和綜合其他數(shù)

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