發(fā)布時(shí)間：2020-07-26 19:47

【摘要】：目的探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSC)移植聯(lián)合組織工程材料透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid,HA)對瘢痕性聲帶固有層的組織再生的作用。方法獲取培養(yǎng)鑒定得到大鼠的BM-MSC后運(yùn)用綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)標(biāo)記大鼠的BM-MSC。在體外實(shí)驗(yàn)中,通過流式細(xì)胞儀檢測GFP標(biāo)記的BM-MSC細(xì)胞的增殖和表達(dá)來評估大鼠BM-MSC嵌入透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid,HA)的兼容性和穩(wěn)定性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,將16只大鼠隨機(jī)分為4組,根據(jù)右側(cè)聲帶損傷1月后注射治療采用不同的注射物命名為生理鹽水組(S組)、BM-MSC(M組)、HA(E組)、BM-MSC植入HA(M+E組)。所有的大鼠右側(cè)聲帶損傷1個(gè)月后,分別注射生理鹽水(S組)、BM-MSC(M組)、HA(E組)、BM-MSC植入HA(M+E組),通過注射方法治療瘢痕形成的聲帶。在治療后的1個(gè)月,檢測Ⅲ型前膠原肽(procollagen-III)、纖連蛋白(Fibronectin,FN)、透明質(zhì)酸合酶-III(Hyaluronic acid synthase 3,HAS3)、透明質(zhì)酸酶(Hyaluronidase 3,HYAL-3)、平滑肌肌動蛋白(Smoothelin,SMA)以及轉(zhuǎn)化生子因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)的m RNA的表達(dá)水平,做免疫組化評價(jià)治療效果;GFP標(biāo)記的存活的BM-MSC的通過免疫熒光來評估;將各組大鼠喉標(biāo)本切片使用蘇木素和伊紅(Hematoxylin and Eosin,HE)染色后于10倍鏡下分析大鼠聲帶固有層厚度,以正常大鼠的固有層作為對照,固有層厚度的取值:最厚部位厚度、最薄部位厚度以及中間部位厚度這3個(gè)數(shù)值的中值。結(jié)果BM-MSC植入HA在體外生長表達(dá)Sca-1、透明質(zhì)酸受體CD44陽性,并能繼續(xù)增殖。在體內(nèi)研究中,GFP標(biāo)記的BM-MSC注射治療瘢痕聲帶1月后仍能檢測到存活的BM-MSC。植入在HA的BM-MSC組III型前膠原、纖連蛋白,TGF-β1水平升高。植入在HA的BM-MSC,相比單獨(dú)注射BM-MSC組,SMA表達(dá)下調(diào),而HYAL3表達(dá)上調(diào);同生理鹽水組比較,HAS3相比沒有變化,大鼠的SMA表達(dá)下調(diào),而HYAL3表達(dá)上調(diào)。BM-MSC組、BM-MSC聯(lián)合HA治療組和HA治療組的固有層厚度明顯小于對照組,和正常組接近。結(jié)論將BM-MSC和HA聯(lián)合注射到大鼠受損的聲帶中,可促進(jìn)聲帶固有層細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的沉積和生長因子的產(chǎn)生,而不影響成肌纖維細(xì)胞的分化,促進(jìn)瘢痕聲帶的修復(fù)。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R767.91
【圖文】：

酶標(biāo)儀數(shù)據(jù)分析軟件（KC 4 from BioTek）用于熒光分析，整個(gè)操作程序避免光和熱的干擾。1.3 結(jié)果1.3.1 綠色熒光蛋白標(biāo)記結(jié)果腺病毒轉(zhuǎn)染后 12 h 可見有綠色熒光蛋白 GFP 表達(dá), 1-3 d 內(nèi)表達(dá)熒光細(xì)胞逐漸增多、強(qiáng)度增強(qiáng)，即綠色熒光蛋白標(biāo)記成功。1.3.2 成骨、成脂誘導(dǎo)分化結(jié)果成骨誘導(dǎo) 1 周后 BM-MSC 形態(tài)發(fā)生明顯變化，早期堿性磷酸酶染色顯示藍(lán)紫色片狀沉積，堿性磷酸酶表達(dá)較高，誘導(dǎo) 3 周時(shí)茜素紅染色可見多處鈣沉積形成的礦化結(jié)節(jié)，茜素紅染色可見明顯的鈣結(jié)節(jié)形成；成脂誘導(dǎo)第 2 周，可見多量圓形細(xì)胞，從第 2-3 周，圓形細(xì)胞內(nèi)部有脂滴形成（圖 1.1）并逐漸增多。

CD-44 陽性表達(dá)率達(dá) 92%，BM-MSC 表面標(biāo)志物 Sca-1 表達(dá)率達(dá) 60%。不表達(dá)造血系的細(xì)胞表面標(biāo)志物 CD11b、CD19 和 CD45。此外，BM-MSC 植入HA 培養(yǎng)在無細(xì)胞毒性的熒光標(biāo)記物 3 天通過 Alamar Blue 法統(tǒng)計(jì)呈正增值。即大鼠 BM-MSC 植入 HA 在體外培養(yǎng)時(shí)體表標(biāo)志物表達(dá)陽性，并保持活力和有絲分裂增值的活性。

異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p<0.01)。BM-MSC 注射組的 TGF-β1 mRNA 的表達(dá)水平也比生理鹽水組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p<0.01)；但結(jié)果顯示，HA 注射組的TGF-β1 mRNA 的表達(dá)水平比生理鹽水組低很多，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（(p<0.01)。由上述結(jié)果可以得出：BM-MSC 和 HA 聯(lián)合治療提高影響成肌纖維細(xì)胞的分化，但可促進(jìn) TGF-β1 的釋放；在促進(jìn) TGF-β1mRNA 的表達(dá)上，聯(lián)合注射 BM-MSC 和 HA 也具有協(xié)同作用。比較采用定量實(shí)時(shí) PCR 法分析所得的生理鹽水注射組（S 組)、MSC 注射組（M 組）、HA 注射組（E 組）、BM-MSC 聯(lián)合 HA 注射組（M+E 組）的聲帶固有層各基因的 mRNA 的表達(dá)情況。相比其他組，BM-MSC 聯(lián)合 HA 注射組的細(xì)胞外基質(zhì)基因表達(dá)譜顯示具有最佳治療效果。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張慶翔;胡惠英;孫國燕;于振坤;;聲帶CO_2激光術(shù)后自主修復(fù)情況的臨床研究[J];臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2014年19期

本文編號：2771206