【摘要】：目的糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病最常見的眼部并發(fā)癥,其中增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)已成為致盲的主要眼疾之一。血管新生是NPDR進(jìn)展到PDR的關(guān)鍵過程,這一過程,是血管生長因子和血管抑制因子之間的平衡失調(diào)導(dǎo)致的。因此,尋找理想的抑制新生血管生成的藥物,并調(diào)節(jié)促進(jìn)血管生長因子和抑制血管生長因子之間的平衡,已成為預(yù)防和治療DR的關(guān)鍵。VEGI是一種新的血管新生拮抗劑,能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生、血管形成和腫瘤生長。研究表明,VEGI可以促進(jìn)mFlt1退化并上調(diào)sFlt1表達(dá),從而抑制VEGF,對血管新生起負(fù)性調(diào)節(jié)。本研究將探討VEGI對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用,從而為DR的治療提供新的方向。本課題首先探討VEGI在PDR、NPDR患者與非DM患者玻璃體中的表達(dá)差異;然后以牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象,在高糖狀態(tài)下過表達(dá)VEGI,檢測細(xì)胞增殖、遷移、成管及細(xì)胞因子的改變;構(gòu)建小鼠視網(wǎng)膜新生血管病變模型,視網(wǎng)膜下腔注射VEGI慢病毒表達(dá)載體,應(yīng)用OCT、IVIS等方法探討其對視網(wǎng)膜血管滲漏、血管新生的抑制作用。本研究將為VEGI改善DR病變提供理論基礎(chǔ)。方法本課題分四部分進(jìn)行。第一部分增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者與非增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者玻璃體中VEGI的表達(dá)差異從天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院眼科和天津眼科醫(yī)院玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)患者術(shù)中留取標(biāo)本,需手術(shù)治療的非DM患者16例、NPDR患者19例、PDR患者12例。于手術(shù)過程中留取患者玻璃體組織,置于干冰中。受試者在實(shí)驗(yàn)前簽署了知情同意書,證明對本研究的目的理解,并知道必需的研究流程,愿意加入本研究。同時(shí)收取患者的血糖、血脂、肝腎功能等臨床指標(biāo)。應(yīng)用Western blot檢測技術(shù)檢測二組間VEGF、VEGI等因子的表達(dá)。第二部分VEGI在小鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變模型中的表達(dá)變化由于我們無法獲得人視網(wǎng)膜標(biāo)本,因此無法檢測糖尿病患者視網(wǎng)膜組織中VEGF和VEGI的表達(dá)變化。因此,我們以STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠作為1型DM小鼠模型,以高脂喂養(yǎng)的KK-Ay小鼠作為2型DM小鼠模型,采用OCT檢測小鼠活體視網(wǎng)膜病變情況,并通過HE染色、WB等方法檢測VEGI和VEGF的表達(dá)情況,以及VEGFR1和VEGFR2的表達(dá)情況。第三部分VEGI對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成管變化以及相應(yīng)細(xì)胞因子的影響在細(xì)胞水平,高糖狀態(tài)下過表達(dá)VEGI后,檢測細(xì)胞增殖、遷移、成管變化以及相應(yīng)細(xì)胞因子的改變。分離培養(yǎng)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞,給予不同濃度葡萄糖刺激(25mM,30mM,50mM),轉(zhuǎn)染pcDNA3.1+/VEGI/GFP質(zhì)粒和pcDNA3.1/GFP質(zhì)粒后,應(yīng)用CCK8、migration、mitragel等試驗(yàn)分別檢測細(xì)胞增殖、遷移及成管變化。第四部分VEGI對高氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜新生血管作用的研究構(gòu)建小鼠視網(wǎng)膜新生血管病變模型,新生C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、VEGI干預(yù)組;模型組、VEGI干預(yù)組均置于高氧環(huán)境下飼養(yǎng),最后通過HE染色和熒光素血管灌注及視網(wǎng)膜鋪片觀察視網(wǎng)膜血管變化。結(jié)果1.在我們隨機(jī)選取的臨床標(biāo)本中,DM組患者和對照組大多數(shù)臨床指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。DM組糖化血紅蛋白(HbA1c)明顯高于對照組(P0.01)。T2DM+NPDR組與T2DM+PDR組相比,T2DM+PDR組患者的HbA1c水平較高(P0.05)2.與非糖尿病組相比,DM組患者玻璃體中VEGI的蛋白表達(dá)水平明顯減少;T2DM+NPDR組與T2DM+PDR組相比,T2DM+PDR組患者玻璃體中VEGI的水平進(jìn)一步減少。而與非糖尿病組和T2DM+NPDR組相比,T2DM+PDR組患者玻璃體中VEGF的蛋白表達(dá)水平明顯增加;T2DM+NPDR組與非糖尿病組相比,VEGF的蛋白表達(dá)水平也明顯增加。3.與非糖尿病組相比,DM組患者玻璃體中VEGI/VEGF的比值明顯減低;T2DM+NPDR組與T2DM+PDR組相比,T2DM+PDR組患者玻璃體中VEGI/VEGF的比值減低更加明顯。4.與對照組小鼠相比,STZ造模鼠和KK-Ay小鼠的血糖水平均明顯升高(P0.05)。KK-Ay小鼠血脂水平升高、空腹的胰島素水平(INS)、胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR和胰島素分泌基礎(chǔ)指數(shù)HOMA-β均明顯升高(P0.05)。而STZ造模鼠血脂無明顯變化。5.OCT成像結(jié)果顯示,在DM發(fā)病6個(gè)月,與正常組C57小鼠相比,STZ造模鼠和KK-Ay小鼠視網(wǎng)膜厚度明顯減少。6.HE染色結(jié)果顯示,無論是STZ造模的1型DM小鼠還是KK-Ay代表的2型DM小鼠,在DM發(fā)病6個(gè)月,與正常組C57小鼠比較,其內(nèi)層視網(wǎng)膜層厚度均明顯降低。7.同正常對照組C57小鼠比較,STZ造模鼠和KK-Ay小鼠視網(wǎng)膜組織中VEGI蛋白表達(dá)水平均顯示顯著減低(P0.05),但STZ造模鼠和KK-Ay小鼠之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;同正常對照組C57小鼠比較,STZ造模鼠和KK-Ay小鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF蛋白表達(dá)水平均顯示明顯升高(P0.05),但STZ造模鼠和KK-Ay小鼠之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;同正常對照組C57小鼠比較,STZ造模鼠和KK-Ay小鼠視網(wǎng)膜組織中pAKT/tAKT比值明顯升高(P0.05)。8.在30mM和50mM的高糖狀態(tài)下,牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和成管均明顯增加,而轉(zhuǎn)染VEGI后牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和成管均明顯受到抑制。9.HE染色顯示,正常組小鼠,視網(wǎng)膜內(nèi)界膜光滑平整,未出現(xiàn)異常結(jié)構(gòu),各層視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清楚,視網(wǎng)膜各層厚度正常,極少有內(nèi)皮細(xì)胞突破內(nèi)界膜。而模型組小鼠,視網(wǎng)膜各層厚度明顯減少,并有大量內(nèi)皮細(xì)胞突破內(nèi)界膜,向玻璃體腔生長,排列異常紊亂,并有新生血管形成。VEGI干預(yù)組小鼠視網(wǎng)膜突破內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)較模型組少,內(nèi)界膜完整性也較好。10.熒光素血管灌注及視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果顯示,正常小鼠可見視盤血管從視盤部放射狀發(fā)出,均勻分布、自然走行,未觀察到明顯無灌注區(qū)和滲漏出的造影劑;模型組:觀察到大片無灌注區(qū)出現(xiàn)在視乳頭的周邊,視網(wǎng)膜的大血管不規(guī)則擴(kuò)張,迂曲走行,在無灌注區(qū)的周圍出現(xiàn)新生血管叢,并伴有明顯的熒光滲漏;VEGI干預(yù)組:在視乳頭的周邊沒有明顯的無灌注區(qū)和新生血管叢,熒光滲漏減輕。結(jié)論1.與NDM和NPDR患者相比,PDR患者玻璃體中VEGI水平降低而VEGF水平增加,且VEGI/VEGF的比值明顯減低。2.與NPDR患者相比,PDR患者玻璃體中VEGI水平降低而VEGF水平增加,且VEGI/VEGF的比值明顯減低。3.同正常對照組C57小鼠比較,STZ造模鼠和KK-Ay小鼠視網(wǎng)膜組織中內(nèi)層視網(wǎng)膜厚度均明顯降低,VEGI蛋白表達(dá)水平均顯示顯著減低,VEGF蛋白表達(dá)水平均顯示明顯升高,pAKT/tAKT比值明顯升高,VEGFR1蛋白表達(dá)水平均顯示顯著減低,而VEGFR2蛋白表達(dá)水平均顯示顯著升高。4.高糖可以促進(jìn)牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和成管,以及增加牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá),50mM的葡萄糖效果更明顯;VEGI轉(zhuǎn)染后可以明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和成管。5.高氧誘導(dǎo)的模型組小鼠有大量內(nèi)皮細(xì)胞向玻璃體腔突出,排列紊亂,并伴有新生血管形成;VEGI干預(yù)組的小鼠視網(wǎng)膜中向內(nèi)界膜突破的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目較模型組少,內(nèi)界膜的完整性也較好。6.高氧誘導(dǎo)的模型組小鼠視乳頭的周邊出現(xiàn)較大的無灌注區(qū),在無灌注區(qū)的周圍出現(xiàn)新生血管叢,并伴有明顯的熒光滲漏;VEGI干預(yù)組的小鼠視乳頭的周邊沒有明顯的無灌注區(qū)和新生血管叢,熒光滲漏減輕。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2;R774.1
【圖文】：

的表達(dá)可能為臨床提供了新的治療思路，起到抑制視網(wǎng)膜血管新生，防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用（圖 1）。為了解 VEGI 與 DR 間的相關(guān)性，本研究通過非糖尿病患者、糖尿病患者中無視網(wǎng)膜病變、非增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變、增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者玻璃體中 VEGI、VEGF、VEGFR 的表達(dá)差異，探討其在動物水平能否改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變模型中視網(wǎng)膜血管滲漏、血管新生等情況，明確 VEGI 能否在細(xì)胞水平抑制視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和成管，為臨床治療 DR 提供新的理論依據(jù)，從而為糖尿病視網(wǎng)膜病變的藥物治療提供新的方向。

圖 2 western blot 檢測玻璃體中 VEGI 與 VEGF 的表達(dá)水平NDM T2DM+NPDR T2DM+PDR0.00.51.01.5elatRievxpreessonifoEVIG**#圖 3 三組玻璃體中 VEGI 表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析注：與 NDM 組相比，*P<0.05；與 T2DM_NPDR 組相比，#P<0.0

網(wǎng)膜內(nèi)出血：在視網(wǎng)膜上出現(xiàn)更多的，較大的紅色不規(guī)則病變，并不會影響視力，治療及時(shí)一般 3 到 4 個(gè)月內(nèi)可以恢復(fù)（圖 6B）；（3）硬性滲出：黃色不規(guī)則形狀的病變，代表視網(wǎng)膜脂類和蛋白質(zhì)沉積，伴有視網(wǎng)膜增厚者為糖尿病性黃斑水腫的典型表現(xiàn)（圖 6C）；（4）棉絮斑：淺羽緣白色病變，代表毛細(xì)血管閉塞造成的神經(jīng)纖維層梗塞（圖 6D）；（5）視網(wǎng)膜微血管異常：毛細(xì)血管閉合導(dǎo)致血管重塑的改變；（6）串珠狀靜脈：擴(kuò)張、迂曲，不規(guī)則口徑靜脈，鄰近毛細(xì)血管無灌注；（7）黃斑水腫：血-視網(wǎng)膜屏障破裂促使血漿從血管滲漏入視網(wǎng)膜導(dǎo)致視網(wǎng)膜腫脹，可以出現(xiàn)在 DR 的早期，常伴隨有硬性滲出和微血管瘤（圖6C）；（8）新生血管：新血管異常增殖，可延伸至玻璃體腔引起玻璃體出血（圖6E）；（9）玻璃體出血：玻璃體腔內(nèi)出血（圖 6E）；（10）牽引性視網(wǎng)膜脫離：纖維增生伴新生血管的收縮可以將視網(wǎng)膜脫離其解剖位置；（11）新生血管性青光眼：新血管生長進(jìn)入眼睛的排水系統(tǒng)并引起堵塞，升高眼壓。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 戎健,邱鴻鑫,汪恕萍;Ⅱ型糖尿病患者血紅蛋白晚期糖基化終末產(chǎn)物與視網(wǎng)膜病變的關(guān)系[J];中華眼底病雜志;2000年03期

本文編號：2766829