【摘要】：目的：建立高糖狀態(tài)下視網膜神經元細胞模型,探討外源性腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)對高糖狀態(tài)下視網膜神經元凋亡的保護效應,及可能的細胞內信號傳遞機制。同時建立糖尿病大鼠動物模型,探討其視網膜組織病理學變化,以及與視網膜BDNF、酪氨酸激酶受體B (TrkB)、細胞外信號調節(jié)蛋白激酶(ERK)、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)表達變化的關系,為BDNF潛在的臨床應用價值提供理論依據。 方法：本研究分兩大部分進行。第一部分：1、以0、5.5、15、25、35mmol/L不同濃度葡萄糖分別作用于原代培養(yǎng)的Wistar大鼠視網膜神經元24、48、72h,采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法及流式細胞儀分析檢測神經元的存活率、凋亡率,確定葡萄糖最適干預濃度及時間,建立原代培養(yǎng)的大鼠視網膜神經元的高糖模型。2、予以75、100、125ng/mL不同濃度BDNF干預高糖狀態(tài)下視網膜神經元96h后,采用MTT法及流式細胞儀分析檢測神經元的存活率、凋亡率的變化,采用免疫細胞化學染色法觀察BDNF受體TrkB的蛋白表達變化,確定BDNF最適干預濃度及時間。3、采用Western Blot法及逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測4個不同組(正常對照組,正常對照+BDNF組,高糖模型組,高糖+BDNF組)的TrkB、ERK的蛋白及mRNA, PTrkB、PERK蛋白的表達水平,分析BDNF對高糖狀態(tài)下視網膜神經元中TrkB、ERK磷酸化的影響。第二部分：1、建立糖尿病大鼠動物模型,以正常大鼠為對照,分別于糖尿病成模后4、12、24W,采用蘇木素/伊紅(HE)染色觀察大鼠后極部視網膜總厚度、視網膜神經節(jié)細胞(RGCs)計數(shù)以及視網膜組織形態(tài)學變化,透射電鏡觀察糖尿病24W大鼠視網膜各層組織細胞的超微結構變化。2、于糖尿病4、12、24W,采用免疫組織熒光化學法、免疫組織化學法、Western blot方法分別檢測糖尿病組與正常對照組大鼠視網膜GFAP、TrkB及ERK、BDNF蛋白的表達,采用RT-PCR法檢測兩組大鼠視網膜TrkB、ERK、BDNFmRNA的表達。 結果：第一部分：1、隨葡萄糖濃度的增加及時間的延長,視網膜神經元的存活率下降、凋亡率增多,以35mmol/L葡萄糖干預72h的神經元存活率(OD值：0.0268±0.0116)下降、凋亡率(40.123±7.576%)增加最為顯著(p0.01)。2、隨著BDNF濃度的增加,高糖狀態(tài)下視網膜神經元存活率增加、凋亡率下降,伴隨著BDNF受體TrkB蛋白表達增高,以100ng/mlBDNF干預96h組凋亡率(3.458±1.531%)下降及TrkB蛋白表達增高最為顯著(p0.05)。3、TrkB蛋白及mRNA在其它各組的表達均較正常對照組增加(p0.05),高糖+BDNF組比較高糖組TrkB表達亦增加(p0.05)；ERK蛋白及mRNA表達水平在各組之間無差異(p0.05); PERK, PTrkB蛋白在高糖組的表達與正常對照組比較無差異(p0.05),正常對照+BDNF組與高糖+BDNF組比較其它2組PERK、PTrkB表達顯著增加(p0.05),高糖+BDNF組比較其它各組PERK、PTrkB表達顯著增加(p0.05)。第二部分：1、糖尿病組在12、24W兩個時間點與正常組相比較,后極部視網膜總厚度明顯變薄(60.26±4.33.52.11±5.23μm), RGCs細胞數(shù)減少(67.57±2.59、54.93±2.02個),差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。糖尿病24W透射電鏡觀察顯示：視網膜RGCs及神經膠質細胞有凋亡征象。2、免疫組織熒光化學法檢測顯示：隨病程增加,GFAP蛋白在糖尿病大鼠視網膜的表達依次增強。免疫組織化學法及RT-PCR法檢測顯示：在病程4W時糖尿病大鼠視網膜的TrkB蛋白及mRNA表達比較正常組明顯增加(p0.05),12W時表達比較正常組明顯下降,24W時下降更明顯(p0.01)；病程4、12、24W時糖尿病大鼠視網膜的ERK蛋白及1mRNA的表達均較正常組增加,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),但糖尿病各組之間比較無差異(p0.05)。Western blot法及RT-PCR法檢測顯示：隨病程增加,糖尿病大鼠視網膜BDNF蛋白及mRNA表達依次下降,比較正常組差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),且糖尿病各組之間也有統(tǒng)計學差異(p0.05)。 結論：1、體外高糖水平可誘導視網膜神經元的凋亡。2、外源性BDNF對高糖誘導的視網膜神經元的凋亡具有保護作用,并能有效上調神經元細胞內TrkB蛋白及mRNA、PERK蛋白、PTrkB蛋白的表達,從而可能通過細胞外信號調節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)信號轉導途徑調控視網膜神經元的凋亡。3、早期糖尿病大鼠動物模型存在神經視網膜的改變(RGCs及神經膠質細胞的凋亡),可能是研究早期糖尿病神經元病變有價值的模型。4、早期糖尿病大鼠神經視網膜病變可能與BDNF、TrkB蛋白及mRNA水平降低,GFAP蛋白、ERK蛋白及mRNA水平增高有關。
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R774.1
【圖文】：

糖在72h、25mmol/L葡萄糖在48h、72h，比較正常對照組有顯著性差異(p<0.05)。且35mmol/L葡萄糖組在72h比較其它組凋亡率有非常顯著性意義(p<0.001)。(表1一1一2，圖1一1一8、9、10、11)

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自陣莽.材二圖1一2一3不同濃度BDNF干預高糖狀態(tài)下視網膜神經元96h后的凋亡率圖注:(l)第2組較其它組凋亡率高(P<o01)。(2)第1組、4組、5組之間均無差異(p>0.05)。第l組與2、3組有差異(p<o刃l(wèi))。

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本文編號：2759095