【摘要】：目的:探討AChE是否調(diào)控糖尿病視網(wǎng)膜病變炎癥反應(yīng),并探索其調(diào)控的分子機制。方法:(1)本實驗通過雄性C57BL/6J小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素構(gòu)建糖尿病動物模型(DM)并通過標準飼料中添加AChE抑制劑多奈哌齊干預處理。實驗分為Vehicle+Non-DM組、Vehicle+DM組、Donepezil+Non-DM組、Donepezil+DM組。Western Blot測定各組視網(wǎng)膜ICAM-1、Albumin、ZO-1的表達,免疫熒光技術(shù)檢測各組中ICAM-1、GFAP、VEGF表達,刀豆凝集素灌注法檢測視網(wǎng)膜血管白細胞粘附,視網(wǎng)膜染色鋪片檢測視網(wǎng)膜上緊密連接蛋白Claudin5表達情況。同時采用AChE基因缺陷小鼠建立DM動物模型,實驗分為AChE+/++Non-DM組、AChE+/++DM組、AChE+/-+Non-DM組、AChE+/-+DM組,Western Blot測定各組視網(wǎng)膜ICAM-1、ZO-1的表達,免疫熒光技術(shù)檢測各實驗組視網(wǎng)膜上ICAM-1、GFAP、VEGF表達,伊文思藍血管通透性分析檢測各組小鼠視網(wǎng)膜血管滲漏程度,視網(wǎng)膜染色鋪片檢測緊密連接蛋白Claudin5表達情況。(2)建立DM動物模型,含多奈哌齊的標準飼料喂養(yǎng)糖尿病小鼠。Western Blot測定各組視網(wǎng)膜NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達,免疫熒光技術(shù)檢測各實驗組視網(wǎng)膜上Caspase-1的表達。(3)進一步,采用Caspase-1基因缺陷小鼠建立DM動物模型,Western Blot測定各組視網(wǎng)膜IL-1β、ICAM-1、GFAP、Albumin的表達,刀豆凝集素灌注法檢測視網(wǎng)膜血管白細胞粘附。結(jié)果:(1)AChE明顯上調(diào)糖尿病小鼠視網(wǎng)膜ICAM-1、Albumin、ZO-1、VEGF的表達,增加DM組視網(wǎng)膜白細胞粘附及血管滲漏,激活視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞,并且這些能被AChE抑制劑多奈哌齊以及基因敲除AChE所逆轉(zhuǎn)。(2)DM組視網(wǎng)膜NLRP3、Caspase1、IL-1β的表達較Non-DM組明顯上調(diào),且多奈哌齊抑制AChE表達后以上檢測指標較DM組降低。(3)基因敲除Caspase-1表達可逆轉(zhuǎn)DM組小鼠視網(wǎng)膜上IL-1β、ICAM-1、GFAP、Albumin的升高,降低視網(wǎng)膜白細胞粘附。結(jié)論:這些結(jié)果表明,AChE可調(diào)控糖尿病小鼠視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng),其機制可能是通過激活NLRP3-Caspase-1炎癥小體實現(xiàn)的,為今后更好地治療DR奠定新的理論基礎(chǔ)和提供新的藥物靶點。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2;R774.1
【圖文】：

18圖 3.1 多奈哌齊降低糖尿病小鼠視網(wǎng)膜 ICAM-1 表達及血管處白細胞粘附（A 圖：WesternBlot 檢測 Non-DM 組、DM 組 AChE 表達水平，β-actin 作為內(nèi)參。實驗至少重復三次，利用 T 檢驗進行統(tǒng)計分析，繪制柱形圖（n=3，**P<0.01）。B 圖：Western Blot 檢測Vehicle+Non-DM 組、Vehicle+DM 組、Donepezil+Non-DM 組、Donepezil+DM 組 ICAM-1 表達水平，β-actin 作為內(nèi)參。實驗至少重復三次，利用 T 檢驗進行統(tǒng)計分析，繪制柱形圖（n=3，**P<0.01， P<0.01）。C 圖：Scale bar=50μm，免疫熒光檢測 Vehicle+Non-DM 組、Vehicle+DM組、Donepezil+Non-DM 組、Donepezil+DM 組的 ICAM-1 表達情況，紅色熒光標記 ICAM-1，藍色熒光標記細胞核。D 圖：Leukostasis 檢測 Vehicle+Non-DM 組、Vehicle+DM 組、Donepezil+Non-DM 組、Donepezil+DM 組視網(wǎng)膜血管白細胞粘附情況，箭頭所指為淤滯及粘附的白細胞，實驗至少重復三次，利用 T 檢驗進行統(tǒng)計分析，繪制柱形圖（n=3，**P<0.01， P<0.01）。）

20圖 3.2 多奈哌齊減輕糖尿病小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)及血管病變（A 圖：Scale bar=50μm，免疫熒光檢測 Vehicle+Non-DM 組、Vehicle+DM 組、Donepezil+Non-DM 組、Donepezil+DM 組的GFAP 表達情況，紅色熒光標記 GFAP，藍色熒光標記細胞核。B 圖：Scale bar=50μm，免疫熒光檢測 Vehicle+Non-DM 組、Vehicle+DM 組、Donepezil+Non-DM 組、Donepezil+DM組的 VEGF 表達情況，紅色熒光標記 VEGF，藍色熒光標記細胞核。C 圖：Western Blot檢測各組視網(wǎng)膜 Albumin 表達水平，β-actin 作為內(nèi)參。實驗至少重復三次，利用 T 檢驗進行統(tǒng)計分析，繪制柱形圖（n=3，**P<0.01， P<0.01）。D 圖：視網(wǎng)膜染色鋪片檢測各組視

圖 3. 3 AChE 基因敲除糖尿病小鼠視網(wǎng)膜炎癥因子 ICAM-1 表達下調(diào) （A 圖：WesterBlot 檢測 AChE+/+ +Non-DM 組、AChE+/+ +DM 組、AChE+/- +Non-DM 組、AChE+/- +DM組的 ICAM-1 表達水平，β-actin 作為內(nèi)參。實驗至少重復三次，利用 T 檢驗進行統(tǒng)計分析繪制柱形圖（n=3，**P<0.01， P<0.01）。C 圖：Scale bar=50μm，免疫熒光檢測 AChE+/+Non-DM 組、AChE+/+ +DM 組、AChE+/- +Non-DM 組、AChE+/- +DM 組的 ICAM-1 表達情況，紅色熒光標記 ICAM-1，藍色熒光標記細胞核。）3.4AChE 基因敲除糖尿病小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)及血管病變減輕此部分通過免疫熒光檢測糖尿病小鼠中 GFAP 表達，實驗分為 AChE+/+Non-DM 組、AChE+/+ +DM 組、AChE+/- +Non-DM 組、AChE+/- +DM 組，實驗結(jié)果如圖所示：A 圖： AChE+/+ +DM 組較 AChE+/+ +Non-DM 組小鼠視網(wǎng)膜的 GFAP 表達上調(diào)，且 AChE+/- +DM 組小鼠 GFAP 表達較 AChE+/+ +DM 組小鼠視網(wǎng)膜降低，GFAP 為紅色熒光。同時我們通過免疫熒光染色及伊文思藍血管通透性分析檢測視網(wǎng)膜 VEGF 表達和血管滲漏改變，實驗結(jié)果如圖所示：B 圖AChE+/+ +DM 組較 AChE+/+ +Non-DM 組小鼠視網(wǎng)膜的 VEGF（紅色熒光）表達升高，且 AChE+/- +DM 組小鼠 VEGF 表達較 AChE+/+ +DM 組小鼠視網(wǎng)膜降

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本文編號：2756150