【摘要】：目的探討順鉑誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞自噬的作用及機(jī)制。方法Y79細(xì)胞按濃度為0、1、5、10、20μM加入Cis培養(yǎng),CCK-8法檢測細(xì)胞IC_(50)。將Y79細(xì)胞分為對照組(Control)、順鉑組(Cis)和順鉑聯(lián)合應(yīng)用自噬阻斷劑3-甲基腺嘌呤組(Cis+3-MA),透射電鏡觀察自噬體;單丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC)對細(xì)胞進(jìn)行染色,流式細(xì)胞儀檢測各組光密度(OD)值;各組細(xì)胞按0、5、10、25、50、100μM加入Cis培養(yǎng),CCK-8法檢測細(xì)胞抑制率;Annexin V/PI雙染流式法檢測各組細(xì)胞凋亡;q-PCR檢測各組細(xì)胞[凋亡及存活相關(guān)(Bax,Bcl-2)以及耐藥相關(guān)(MRP3、MRP7、P-gp)]基因的轉(zhuǎn)錄情況。Fluo-4 AM鈣離子熒光探針檢測Y79細(xì)胞加入順鉑前后細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平變化;Western Blot檢測CaMKK2、AMPK、mTORC1、LC3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果順鉑處理細(xì)胞后,透射電鏡觀察到雙層或多層膜的球狀結(jié)構(gòu)的自噬小體明顯增多,應(yīng)用自噬阻斷劑3-MA后,自噬小體數(shù)量減少;MDC染色流式細(xì)胞儀測定OD_(355),Cis組OD值至明顯高于Control組(P0.01),Cis+3-MA組OD值低于Cis組(P0.05);應(yīng)用自噬阻斷劑3-MA預(yù)處理細(xì)胞后,各濃度點(diǎn)順鉑抑制率均大于單獨(dú)應(yīng)用順鉑處理的細(xì)胞;順鉑處理細(xì)胞后,與Control組相比凋亡率增加(P0.05)應(yīng)用3-MA下調(diào)自噬水平后,凋亡率進(jìn)一步增加(P0.05);與Control組相比,Cis組抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)(P0.01),Bax表達(dá)上調(diào)(P0.01),各組細(xì)胞耐藥相關(guān)基因MRP3、MRP7和P-glycoprotein轉(zhuǎn)錄水平降低(P0.01);加入自噬阻斷劑3-MA后Bcl-2表達(dá)進(jìn)一步下降(P0.01),Bax較Cis組上升(P0.05),耐藥相關(guān)基因MRP3、MRP7和P-glycoprotein轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步降低(P0.05)。Fluo-4 AM鈣離子探針染色激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示,順鉑處理腫瘤細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)熒光水平明顯高于對照組;Western-blot結(jié)果顯示,與Control組比較,Cis組鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶激酶2(CAMKK2)、p-AMPK、LC3II明顯上調(diào),mTORC1下調(diào)(P0.05)。結(jié)論1順鉑可以誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞產(chǎn)生自噬。2抑制自噬可以提高順鉑誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞的凋亡率,并降低細(xì)胞耐藥相關(guān)基因的表達(dá),說明順鉑誘導(dǎo)的自噬對細(xì)胞起保護(hù)作用并參與了視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞的化療耐藥。3順鉑可能是通過提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度激活CAMKK2/AMPK/mTORC1通路誘導(dǎo)Y79細(xì)胞產(chǎn)生自噬的。
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.7
【圖文】：

圖 1 透射電鏡觀察各組細(xì)胞產(chǎn)生自噬的情況Fig. 1 observation of autophagy by transmission electron microscope圖 2，表 9：Western-blot 結(jié)果灰度值計(jì)算：Control 組 LC3 II /LC3 I 的值為0.30±0.05、Cis 組為 0.54±0.08、Cis+3-MA 組為 0.39±0.03，經(jīng) t 檢驗(yàn)，Cis 組和Control 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Cis 組灰度值較高。CL3I/I0.20.40.60.8***（a） （b）

圖 1 透射電鏡觀察各組細(xì)Fig. 1 observation of autophagy by tran圖 2，表 9：Western-blot 結(jié)果灰度值計(jì)0.30±0.05、Cis 組為 0.54±0.08、Cis+3-MA Control 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Ci（a） （

注：*表示 Cis 與 Control 相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。**表示 Cis+3MA 與 Cis 相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。.4.3 順鉑誘導(dǎo)的自噬對 Y79 細(xì)胞凋亡的影響自噬對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞順鉑抑制率及凋亡的影響見圖 4-5，表 11。圖 4，表 11：應(yīng)用自噬阻斷劑 3-MA 預(yù)處理細(xì)胞后，各濃度點(diǎn)順鉑抑制率均單獨(dú)應(yīng)用順鉑處理的細(xì)胞。凋亡結(jié)果顯示，control 組凋亡率為（10.19±0.49)%is 組凋亡率為（21.20±0.90）%，Cis+3-MA 組凋亡率上升為(26.49±0.31）%，經(jīng)驗(yàn)，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Cis 組與 Control 組相比凋亡率升高，加入A 后，凋亡率繼續(xù)上升。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2752471